Isolierung und Strukturaufklärung peptidischer und niedermolekularer bioaktiver Naturstoffe mittels LC/ESI-MS und GC/MS

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Habilitationsschrift, die auf 13 Original- und Übersichtsarbeitenberuht, werden Beiträge zur Isolierung und Strukturaufklärung peptidischer undniedermolekularer bioaktiver Naturstoffe mittels LC/ESI-MS und GC/MS kumulativvorgestellt:Der erste Teil dieser Arbeit ist der Isolierung und Sequenzierung neuer und bereitsbekannter Peptaibiotika nicht-ribosomal biosynthetisierter, alpha,alpha-dialkylaminosäurehaltigerPeptidantibiotika aus Pilzen gewidmet. Im Mittelpunkt standen hierbei die Suche nachneuen peptidischen Wirkstoffen für einen potentiellen Einsatz in der Medizin bzw. imbiologischen Pflanzenschutz sowie die Bedeutung der gefundenen Sekundärmetaboliten fürdie moderne Pilztaxonomie. Unter Verwendung moderner massenspektrometrischerVerfahren wie der HPLC-gekoppelten ESI-Quadrupol/TOF-Hybrid-MS mit Pulsarfunktion(ESI-QqTOF-MS), der Kopplung der nicht-wäßrigen Kapillarelektrophorese (NACE) mitESI-MS und der HPLC-gekoppelten ESI-Ionenfallen-MS (ion trap, IT) sowie einerpeptaibiomischen Vorgehensweise als neuartigem methodisch-analytischem Ansatz wurdenaus Pilzen der Gattung Trichoderma/Hypocrea etwa 100 größtenteils neue Sequenzen linearerPeptaibiotika ermittelt. Diese fielen entweder durch ihre neuroleptische Aktivität oder ihreantifungale Wirkung auf die Erreger latenter Rebholzkranheiten der Weinrebe auf. Erstmaligwurde über den Nachweis von N-terminalem Pyroglutamat und C-terminalem L-Alaninol alsneue Strukturelemente von Peptaibiotika berichtet. Die Kombination von phylogenetischmolekulartaxonomischerMethoden mit modernen massenspektrometrischen Verfahren führtezur Beschreibung des Brevicompactum-Cladus als neuem Zweig mit vier neuen Arten(Trichoderma arundinaceum, T. protrudens, T. turrialbense und Hypocrea/Trichodermarodmanii) im Stammbaum der Gattung Trichoderma/Hypocrea. Außerdem wird auf neuebzw. ungewöhnliche Produzenten, Strukturelemente und Baupläne von Peptaibiotika, so z. B.die neue Unterfamilie der Cyclopeptaibiotika, eingegangen, die Geschichte und Perspektivender Peptaibiotikaforschung werden beleuchtet sowie das Vorkommen von alpha,alpha-Dialkylaminosäuren in der belebten und unbelebten Natur thematisiert. Schließlich wurdendie Trifluoracetolyse und die sich anschließende Analyse der Spaltprodukte mittels ESI-MSals geeignetes Verfahren zur Sequenzierung und Strukturaufklärung von Modellpeptiden undPeptaibiotika untersucht und ein repetitiver Spaltmechanismus für homo-Aib-haltige Peptideund Peptaibiotika postuliert.Der zweite Teil der Arbeit stellt die Kopplung von HPLC und hochauflösender ESIMassenspektrometrieals eine unentbehrliche Komplementärtechnologie für die GC/MS beimso genannten Metabolic Profiling am Beispiel von Arabidopsis thaliana als pflanzlichenModellorganismus dar.Der dritte Teil der Arbeit beleuchtet die Perspektiven der Peptaibiotikaforschung imnächsten Jahrzehnt sowie die Massenspektrometrie als analytische Hochleistungsmethode inden Lebenswissenschaften.Zusammenfassend ist die Massenspektrometrie als derzeit vielseitigster undleistungsfähigster Zweig der Bioanalytik einzuschätzen, deren interdisziplinäre Rolle undBedeutung für die Lebenswissenschaften in den kommenden Jahren noch weiter wachsenwird. This cumulative habilitation thesis, which is divided into three chapters, comprises of 13original research and review articles on the isolation and structural elucidation of bioactivepeptidic and low-molecular weight natural products by LC/ESI-MS and GC/MS:The first part of this work is devoted to the isolation and sequencing of new andrecurrent peptaibiotics, i. e. fungal peptide antibiotics of non-ribosomal origin containing alpha-dialkyl alpha-amino acids. It is focussed on the search for novel peptidic components for potentialuse in medicine or as biocontrol agents (BCA) in agriculture. A second important aspect is thesignificance to modern fungal taxonomy of the secondary metabolites discovered. Usingstate-of-the-art mass spectrometric tools such as HPLC coupled to a pulsar ESI-QqTOF-MS,nonaqueous capillary electrophoresis coupled to ESI-MS, HPLC coupled to ESI-ion-trap-MS,as well as the recently established method of peptaibiomics, more than 100 novel andrecurrent linear peptaibiotics produced by strains and species of the genusTrichoderma/Hypocrea were sequenced. Notably, some of them displayed neurolepticactivity, whereas others were highly effective against fungal diseases of grapevine trunks.Furthermore, N-terminal pyroglutamate and C-terminal L-Alaninol are reported as novelconstituents of peptaibiotics for the first time. The combination of morphological analyses,molecular phylogenetics and state-of-the-art mass spectrometric tools culminated in therecognition of the Brevicompactum clade as a separate, novel lineage, including T.brevicompactum s. s. as well as four new species, T. arundinaceum, T. protrudens, T.turrialbense, and H./T. rodmanii. New and uncommon fungal producers, structural elements,and building schemes of peptaibiotics as well as the history of research in this field arereviewed, and a new subfamily of peptaibiotics, the so-called cyclopeptaibiotics, isintroduced. Future prospects for peptaibiotic research are discussed, and the distribution ofbiotic and abiotic alpha-dialkyl alpha;-amino acids is critically scrutinised. Finally, trifluoroacetolysisof peptaibiotics as well as peptides and subsequent analysis of its cleavage products by ESIMSare presented as an effective tool for sequencing and structural elucidation of modelpeptides and peptaibiotics, and a repetitive cleavage mechanism for Aib-containing peptidesis postulated.The second part of this work introduces the benefits of HPLC coupled to electrosprayionisation quadrupole time-of-flight mass spectrometry as an indispensable, complementarytechnique to GC/MS for profiling of secondary metabolites of Arabidopsis thaliana as a plantmodel organism.The third part of this work discusses the future prospects for peptaibiotic research inthe next decade and the role of mass spectrometry as an anaqlytical key technology in lifesciences.In conclusion, mass spectrometry can be characterised as the most versatile andpowerful discipline in bioanalytics whose interdisciplinary role and importance in lifesciences is predicted to grow further in the forthcoming years.