Characterization of the ROS production in ischemia/reperfusion-induced lung injury

Abstract

Pulmonary ischemia/reperfusion lung injury is an important phenomenon encountered in many clinical situations, including lung transplantation and thrombolysis after pulmonary embolism. Pulmonary IR results in endothelial damage and dysfunction leading to the development of high permeability pulmonary edema. Reactive oxygen species (ROS) have been implicated in the pathogenesis of lung ischemia/reperfusion (IR) injury, although their source(s) remains unclear.We studied the role of phagocyte-type NADPH oxidase in this process, using a model of isolated buffer-perfused mouse lungs. Ischemia was induced by stopping perfusion for 90 min. Lung injury was quantified by assessment of lung vascular permeability and fluid accumulation during reperfusion. Production of ROS was measured during reperfusion in perfusate samples from venous outflow by electron spin resonance spectroscopy using the spin probe 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine. The relative contribution of NADPH oxidase expressed on resident leukocytes versus NADPH oxidase on endothelial cells was further studied in bone-marrow (BM)-transplanted chimeras.In wild-type mouse lungs, IR resulted in increased vascular permeability and edema formation that was associated with increased intravascular ROS release. Pretreatment with superoxide dismutase or apocynin, an NADPH oxidase inhibitor, significantly attenuated lung injury and ROS generation. Nox2 is the catalytic subunit of phagocyte-type NADPH oxidase. Decreased tissue injury in lungs from Nox2 knockout mice was associated with reduced ROS production.The relative contribution of NADPH oxidase expressed by resident leukocytes versus endothelial cells was further studied in bone marrow-transplanted chimeras. When NADPH oxidase in resident leukocytes was selectively inactivated by transplanting bone marrow cells from Nox2 knockout mice into wild-type animals, IR-induced tissue injury was comparable to that in wild-type mouse lungs. Conversely, transplanting bone marrow cells from wild-type mice into Nox2 knockout animals selectively reconstituted NADPH oxidase from resident leukocytes and offered protection against IR-induced lung injury.Collectively, these findings suggest that endothelial NADPH oxidase contributes to lung injury in early reperfusion, but leukocyte NADPH oxidase does not. Das pulmonale Ischämie-Reperfusions(IR)-Syndrom ist gekennzeichnet durch eine schwere Beeinträchtigung der Ventilations-/Perfusionsverteilung (Matching), in der Folge einer endothelialen Dysfunktion mit erhöhter mikrovaskulärer Permeabilität. Diese Organschädigung kann klinisch bis hin zur Entwicklung eines kompletten Lungenversagens führen. Diese Form des akuten Organversagens hat eine große klinische Relevanz nach Lungentransplantationen sowie bei der operativen oder fibrinolytischen Desobliteration von Lungengefäßen nach akuten oder chronisch rezidivierenden Embolien. Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wird eine zentrale Bedeutung für die Pathogenese von IR-Schäden beigemessen. Auch bei Ischämie und Reperfusion der pulmonalen Zirkulation wurde eine Generierung von ROS nachgewiesen. Trotz zunehmender Erkenntnisse über die Mechanismen zur Entstehung des I/R-Syndroms wurde die potenzielle Quelle reaktiver Sauerstoffspezies noch nicht eindeutig identifiziert.Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen erfolgten in isoliert perfundierten und ventilierten Lungen von Wildtyp und Nox2-defizienten Mäusen. Die Mauslungen wurden Ischämiezeiten von 1,5 Stunden ausgesetzt. Post-ischämische Perfusionsstörungen wurden mit Hilfe der Quantifizierung der endothelialen Permeabilität durch Messung des kapillären Filtrationskoeffizienten und Nettoflüssigkeitseinlagerung evaluiert. Die ROS-Produktion wurde im intakten Organ mit Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (ESR) durch Verwendung des Spin-traps 1-hydroxy-3-carboxy-pyrrolidine gemessen und in separaten Experimenten durch Zugabe von Superoxiddismutase (SOD) quantifiziert. Zudem wurden durch Knochenmarkstransplantation chimäre Mäuse generiert, um die Differenzierung des relativen Anteils der granulozytären versus der endothelialen Nox2 am IR-Schaden aufzeigen zu können.In Lungen von Wildtyp-Mäusen wurde eine signifikante Superoxid-Freisetzung im Anschluss an die Reperfusion nachgewiesen, weiterhin kam es zur Ausbildung eines Lungenödems als Zeichen eines Lungenschadens. Die Applikation von SOD und NADPH-Oxidase-Inhibitor Apocynin zu Beginn der Ischämiephase inhibierte die erhöhte Permeabilität und Ödembildung bei der Reperfusion. So konnten wir feststellen, dass die Lungen von Nox2-defizienten vor einem Reperfusionsschaden geschützt waren. Weiterhin konnte eine geringere Superoxid-Freisetzung in Lungen von Nox2-defizienten Mäusen nachgewiesen werden.Die selektive Ausschaltung der NADPH-Oxidase intrapulmonaler Leukozyten durch Knochenmarkstransplantation von Nox2-defizienten Mäusen in Wildtypmäuse, zeigte keine ödemprotektive Wirkung. Im Gegensatz hierzu, ließ sich die mikrovaskuläre Schrankenstörung reduzieren, wenn Knochenmark von Wildtypmäusen in Nox2-defiziente Mäuse transplantiert wurde. Erstaunlicherweise konnte eine geringe intravaskuläre ROS-Freisetzung in den Lungen beider chimärer Mäusestämme gezeigt werden.In Anbetracht der gezeigten Ergebnisse konnten wir der endothelialen NADPH-Oxidase die Hauptrolle in der Vermittlung des IR-Schadens der Lunge zuordnen, wohingegen überraschenderweise die leukozytäre NADPH-Oxidase nur eine nach geordneter Rolle zu spielen scheint.