Identifikation von Kardiomyozyten-Differenzierungs-Genen durch einen siRNA-basierenden Screeningansatz

Abstract

Für das Verständnis der Herzentwicklung und deren pathologischen Veränderungen ist die Identifikation von Genen und Signalwegen, welche die Kardiomyogenese kontrollieren notwendig. Die Kardiomyozyten stellen den zellulär größten Anteil am Herzen und bilden damit den Fokus der hier beschriebenen Analysen. Als Modell für die frühe Differenzierung von Kardiomyozyten wurden ES-Zell-abgeleitete Kardiomyozyten generiert. Die Differenzierung und Anreicherung wurde in Suspensionskultur unter horizontaler Rotation über die Bildung von Embryoid Bodies (EBs) und anschließender positiver genetischer Selektion der Kardiomyozyten über eine herzspezifische Antibiotikaresistenz bewerkstelligt. Die Identifikation von Genen, die essentiell für die Entwicklung und Differenzierung ES-Zell-abgeleiteter Kardiomyozyten sind, wurde mithilfe eines funktionellen Screens geleistet. Dieser basiert auf einer lentiviralen siRNA Bibliothek mit einer Komplexität von 178.000 individuellen siRNA-Klonen gegen 40.000 putative mRNAs. Jede mRNA wird somit von 3-5 verschiedenen siRNAs abgedeckt. Die Sequenzen der siRNAs korrespondieren mit den Sonden eines Affymetrix-DNA-Microarrays und ermöglichte somit die Identifikation der individuellen siRNAs in einer heterogenen Population. Es wurde eine stabile, konstitutiv siRNA- exprimierende ES-Zellpopulation mittels lentiviraler Transduktion und anschließender positiver Selektion infizierter Klone hergestellt. Als funktionelle Kontrolle diente die siRNA-vermittelte Suppression der Gata4-Aktivität, welche die kardiomyozytäre Differenzierung in vitro verhindert. An jedem Differenzierungschritt wurden die siRNA-Sequenzen isoliert, amplifiziert und mit Affymetrix-DNA-Microarrays hybridisiert. Die Identifikation der enthaltenen siRNAs jeder Population und deren korrespondierenden Zielgenen wurde mithilfe eines komplexen bioinformathischen Algorithmus geleistet. Die Isolation der für die kardiomyozytäre Differenzierung essentiellen Kandidaten erfolgte über die Bildung von Schnittmengen und dem anschließenden Abgleich mit den Transkriptomen von ES-Zell-abgeleiteten Kardiomyozyten, murinen embryonalen Herz Stadium E8,5 und isolierten murinen neonatalen Kardiomyozyten. Die Validierung der differenzierungs-hemmenden Wirkung der isolierten siRNAs, sowie das Ausmaß ihrer genspezifischen Unterdrückung erfolgte für einige siRNAs im Einzelansatz in vitro. Einige der im Screen identifizierten Kandidaten wurden bereits im Tiermodell als Effektoren der Herzentwicklung beschrieben, interferieren aber nicht notwendigerweise mit der kardiomyozytären Entwicklung. Die bioinformatische Clusteranalyse der Kandidaten erlaubte die Identifikation angereicherter Signalwege und kaskaden, Annotationsknoten nach GO (Gene Ontology), sowie von Genen unbekannter Funktion. Im Rahmen dieser Analyse wurde einige Signalwege und kaskaden, darunter auch Komponenten der Wnt- und Bmp-Signalgebung isoliert, die bereits als einflußnehmend auf die Herzentwicklung und Differenzierung beschrieben wurden. Interessanterweise wurden in dem siRNA-Screen sowohl Komponenten der kanonischen ß-catenin abhängigen als auch alternativen Wnt-Signalgebung, Wnt/Ca2+ and Wnt/PCP identifiziert. Diese Tatsache legt ein bislang noch nicht charakterisiertes Zusammenspiel dieser Signalwege in der frühen Kardiogenese nahe. Neben der zuvor beschriebenen Anreicherung von Faktoren der Signaltransduktion offenbart die GO-Cluster-Analyse einen signifikanten Einfluß von Genen, die mit Ionentransport assoziiert werden auf die Kardiomyozytäre Differenzierung in vitro. Hier sind haupsächlich Proteine, welche den Transport metallischer Ionen, wie Kalium, Natrium und Kalzium gewähleisten angereichert. Einige dieser Proteine wurden bereits mit Mutationen assoziiert, die arrythmische Erkrankungen, wie das LQT- und Brugada-Syndrom zur Folge haben.Insbesondere ermöglicht die Identifikation von Komponenten des Kalziumtransports eine Verbindung zu der Wnt/Ca2+- Signalgebung. Diese Verbindung bildet die Basis zukünftiger Analysen zur weiteren Aufklärung der Rolle von Kalzium, dessen Transport und einflußnehmender Regulationsmechanismen, wie z. B. der Wnt-Signalgebung, im Kontext der kardiomyozytären Differenzierung in vitro und in vivo. The identification of genes and molecular pathways that control cardiomyogenesis is necessary to understand normal as well as pathological aspects of heart development. Since the heart mainly comprises of cardiomyocytes, the early steps of their differentiation is focussed. For the largescale screen, murine embryonic stem cell (ESC) derived cardiomyocytes served as a model for cardiomyocyte development in vitro. The differentiation was initiated in a rotation suspension culture via the formation of embryoid bodies (EBs) followed by enrichment of cardiomyocytes by genetic selection with a heartspecific driven antibiotic resistance. We completed a functional screen based on a complex siRNA library constructed in a lentiviral vector to discover genes that are necessary for the development and differentiation of ESC derived cardiomyocytes. The lentiviral library comprises 178,000 individual siRNA clones targeting 40,000 putative mRNAs resulting in a coverage of 3-5 siRNAs forch each of these mRNAs. Furthermore the siRNAs were designed to correspond to probes of an Affymetrix DNA microarray which allows the identification of each individual siRNA within a heterogenous population. A stable, constitutive siRNA expressing population of ESCs was generated by lentiviral transduction followed by positiv selection of infected cells. The siRNA-mediated supression of Gata4 activity serves as functional control since it blocks the differentiation of cardiomyocytes in vitro. At each step of differentiation siRNAs were isolated, amplified and hybridized to Affymetrix DNA microarrays. The identification of the subset of siRNAs present in each population and the corresponding target gene was managed by a complex bioinformatical algorithm. The group of essential candidates was isolated by building intersections of the populations and subsequently synchronized with the transcriptomes of ESC derived cardiomyocytes, of murine embryonic heart stage E8,5 and isolated murine neonatal cardiomyocytes. To validate the identified siRNAs the block of differentiation upon their application and their knock-down capacity was confirmed in a single approach for a subset of siRNAs in vitro. However a subset of candidates was identified which affects heart development in allready described animal models but do not necessarily interfere with cardiomyocyte differentiation. A bioinformatical cluster analysis of the candidates allowed the identification of enriched signaling pathways and cascades, Gene Ontology (GO) annotational nodes as well as genes of unknown function. This analysis revealed several signaling pathways/cascades including members of BMP and WNT signaltransduction most of which are allready known to contribute to heart development and differentiation. Interestingly the siRNA screen identified components of the canonical ß-catenin dependent as well as alternative signaling for the WNT pathway such as Wnt/Ca2+ and Wnt/PCP. These findings indicate a not yet characterized interplay of these pathways during early cardiogenesis. Beside the enrichment of signal trunsduction mentioned above the GO cluster analysis reveals a significant impact of genes associated with iontransport on cardiomyocyte differentiation in vitro. Mainly proteins providing the transport of the metal cations, such as potassium, sodium and calcium were enriched. Several of these Proteins were already linked to Mutations causing arrythmic diseases such as LQT- and Brugada syndrom. In particular components of the calcium transport enabled the linkage to Wnt/Ca2+-signaling. This provides a basis for further analyses revealing the role of calcium, its transport and regulation via Wnt-signaling in the context of cardiomyocyte differentiation in vitro and in vivo.