Entwicklung eines Expressionssystems für Enzyme in der Lebensmittelindustrie

Abstract

Mit Hilfe des pYSK7 basierten Expressionssystem wurde versucht drei Serinpeptidasen aus Wolfiporia cocos (W. cocos) und Rhizopertha dominica (R. dominica) heterolog und aus Coprinopsis cinerea (C. cinerea) homolog durch den Expressionsorganismus C. cinerea zu exprimieren. Hierzu wurde der Expressionsvektor pYSK7 modifizert, bei dem das Gen von Interesse unter der Kontrolle des gpdII-Promotors und des lcc1-Terminators steht. Die Klonierung der Expressionsvektoren erfolgte mittels homologer Rekombination in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Zur Expression einer Prolyl-spezifischen Serinpeptidase aus dem Braunfäulepilz W. cocos (WcOPsP) wurden insgesamt vier Expressionsvektoren (pYMS1, 2, 3 und 11c) kloniert und C. cinerea damit transformiert. Hierbei verwendete pYMS1 das native WcOPsP Signalpeptid und die Prosequenz. Bei pYMS2 wurde das native WcOPsP Signalpeptid durch das Lcc1 Signalpeptid aus pYSK7 ausgetauscht und bei pYMS3 wurde ebenfalls das Lcc1 Signalpeptid, aber ohne WcOPsP Prosequenz verwendet. Der Kulturüberstand der pYMS1, 2, und 3 Transformanden zeigte an unterschiedlichen Tagen weder Peptidaseaktivität in einem Z-Gly-Pro-4-Nitroanilid-Peptidase spezifischen Assay, noch einen eindeutigen Nachweis des rekombianten Proteins mittels polyklonalem Anti-WcOPsP-Antikörper in einer Western Blot Analyse. Erst durch die Transformation von C. cinerea durch den Expressionsvektor pYMS11c, bei dem das homologe Signalpeptid der Serinpeptidase EAU91794, die native WcOPsP Prosequenz und eine C-terminale rekombinante Histidin-Markierung verwendet wurde, konnte die rekombinante WcOPsP spezifisch mittels Western Blot Analyse im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Es konnte allerdings keine Peptidaseaktivität im Kulturüberstand mittels Z-Gly-Pro-4-Nitroanilid-Peptidase spezifischen Assay festgestellt werden. Eine ausreichende Menge rekombinantes Protein für eine Charakterisierung oder andere Untersuchungen konnte nicht gereinigt werden. Für die Expression der Serinpeptidase aus R. dominica wurden ebenfalls vier Expressionsvektoren kloniert (pYSM5, 6, 7 und 13c) und C. cinerea damit transformiert. Hierbei verwendete pYMS5 das synthetische rdot3 Gen. Da dieses keinerlei Introns aufweist, wurde in pYMS6 ein Intron aus Agaricus bisporus (A. bisporus) zwischen gpdII-Promotor und Start des rdot3 Gens hinzugefügt. In pYMS7 wurde das synthetische Gen N-terminal mit dem Lcc1 Signalpeptid aus pYSK7 verknüpft. Der Kulturüberstand der pYMS5, 6 und 7 Transformanden zeigten keine höhere Peptidaseaktivität im Vergleich zu den Negativkontrollen im Azocasein Assay. Die potentielle Hydrolyse der Prosequenz mittels Faktor Xa führte zu keiner gesteigerten Peptidaseaktivität im Kulturüberstand. Es wurde daher ein weiterer Expressionsvektor pYMS13c kloniert, bei dem ebenfalls das homologe Signalpeptid der Serinpeptidase EAU91794 und eine rekombinante C-terminale Histidin-Markierung verwendet wurde. Weiterhin wurde ein Intron aus A. bisporus zwischen gpdII-Promotor und Start des EAU91794 Signapeptids eingefügt. Im Kulturüberstand der pYMS13c Transformanden konnte kein rekombinantes Protein mittels Histidin-Markierung in der Western Blot Analyse detektiert werden. Da die Expression von heterologen Peptidasen keine Peptidaseaktivität im Kulturüberstand von C. cinerea zeigte, wurde daher versucht eine endogene Serinpeptidase (EAU91794) homolog in C. cinerea mittels des pYSK7 basierten Expressionssystem zu exprimieren. Zur Expression der Serinpeptidase aus C. cinerea wurden insgesamt drei Expressionsvektoren (pYMS15, 15c und 25) kloniert und C. cinerea damit transformiert. Hierbei verwendet pYMS15 das native Gen der EAU91794 unter der Kontrolle des gpdII-Promotors und des lcc1-Terminators. Bei pYMS15c wurde eine rekombinante C-terminale Histidin-Markierung hinzugefügt und bei pYMS25 wurde das native Signalpeptid der EAU91794 durch das Lcc1 Signalpeptid mit einer zusätzlichen Kozaksequenz ersetzt und eine rekombinante C-terminale Histidin-Markierung hinzugefügt. Der Kulturüberstand der pYMS15 Transformanden zeigte eine erhöhte Peptidaseaktivität im Azocasein Assay im Vergleich zu den Negativkontrollen. Da sich die native Peptidaseaktivität nicht von der potentiellen rekombinanten Peptidaseaktivität differenzieren ließ, wurde pYMS15c kloniert und C. cinerea damit transformiert. Im Kulturüberstand der pYMS15c Transformanden konnte mittels Western Blot Analyse gezeigt werden, dass das rekombinante Enzym erfolgreich exprimiert und sekretiert wurde. Das rekombinante Protein wurde mittels FPLC gereinigt, wobei sich zeigte, dass die Peptidaseaktivität nicht mit der Anwesenheit des rekombianten Proteins korreliert. Zusätzlich wurde der Expressionsvektor pYMS25 mit einer zusätzlichen Kozaksequenz versehen, um die Translationsrate der mRNA zu steigern. Der Kulturüberstand der pYMS25 Transformanden zeigte ebenfalls Banden des rekombinanten Proteins in der Western Blot Analyse, was zeigte, dass die EAU91794 auch mittels Lcc1-Signalpeptids sekretiert wurde. Allerdings zeigten die pYMS25 Transformanden im Vergleich zu den pYMS15c Transformanden keine stärkeren Banden des rekombinanten Proteins, was zeigte, dass die zusätzliche Kozaksequenz nicht zu einer gesteigerten Menge an rekombinanten Protein geführt hat. Als ein weiteres Enzym wurde versucht homolog eine Laccase mittels C. cinerea zu exprimieren. Da bereits in C. cinerea einige Laccasen homolog exprimiert werden konnten, wurde in dieser Arbeit sich auf eine Laccase konzentriert, die noch nicht zuvor rekombinant exprimiert wurde. Hierzu wurde der Expressionsvektor pYMS33 kloniert, bei dem die lcc8 unter Kontrolle des gpdII-Promotors, des lcc1-Signalpeptids und dem lcc1-Terminators steht. Ein pYMS33 Transformand zeigte Laccaseaktivität auf ABTS Platten und in Flüssigkultur, obwohl unter Bedingungen kultiviert wurde, bei denen keine nativen Laccasen exprimiert werden. Zusätzlich wurde die Integration der lcc8 Expressionskassette mittels PCR bestätigt. Daher wurde der Kulturüberstand für eine Gelelektrophorese verwendet und die Laccaseaktivität spezifisch gefärbt. Die Proteinbanden wurden sequenziert und als Laccase8 identifiziert. Die Lcc8 wurde mittels FPLC gereinigt und anschließend biochemisch charakterisiert. Es konnte eine spezifische Aktivität von 46,3 U mg-1 erreicht werden. Das Molekulargewicht der Lcc8 betrug 64 und 77 kDa, wobei eine Deglykosylierung zeigte, dass bis zu 10% des Molekulargewichts von der Glykosylierung stammen. Der optimale pH Bereich für katalytische Aktivität lag zwischen 4 bis 5. Die Lcc8 wies eine hohe Thermostabilität von bis zu 300 min bei 50°C auf. Die optimale Temperatur lag bei 54-63°C, während der pI bei 3,3 und 3,4 lag. Es wurden weiterhin Km und Kcat für ABTS und DMP bestimmt. Darüber hinaus wurde ein alternativer Expressionsorganismus für die rekombinante Expression von Peptidasen verwendet. Die Serinpeptidase Rdo_c6991 aus R. dominica sollte heterolog mittels Pichia pastoris (P. pastoris) exprimiert werden. Hierzu wurde der Expressionsstamm GS115 und der Expressionsvektor pPIC9K kommerziell erworben um die Peptidase Rdo_c6991 zu exprimieren. Die Expressionsvektoren pPIC9K-KPep und pPIC9K-PlaPep wurden dafür entworfen. Bei pPIC9K-KPep steht das rdo_c6991 Gen unter der Kontrolle des AOX1 Promotors, dem α-Faktor Sekretionssignal, einer zusätzlichen Kozak-Sequenz und dem AOX1 Terminator, wobei noch eine rekombinante C-terminale Histidin-Markierung hinzugefügt wurde. Bei pPIC9K-PlaPep wurde derselbe Aufbau der Expressionkassette wie bei pPIC9K-KPep verwendet, wobei zwischen dem α-Faktor Sekretionssignal mit der zusätzlichen Kozak-Sequenz und dem rdo_c6991 Gen noch eine Phospholipase A2 (PLA2) Domäne hinzugefügt wurde, um die Sekretion und damit die Ausbeute der rekombinanten Expression zu optimieren. Der Kulturüberstand positiver pPIC9K-KPep und pPIC9K-PlaPep Transformanden zeigten in einer Western Blot Analyse, dass das rekombinante Enzym mit einem Molekulargewicht von ca. 70 kDa bei pPIC9K-KPep und mit einem Molekulargewicht von ca. 100 kDa bei pPIC9K-PlaPep exprimiert und sekretiert wurde. Allerdings zeigten die pPIC9K-PlaPep Transformanden keine stärkeren Proteinbanden des rekombinanten Proteins in einer Western Blot Analyse im Vergleich zu den pPIC9K-KPep Transformanden. Die zusätzliche PLA2 Domäne hat nicht zu einer besseren Expression des rekombinanten Proteins geführt. Daher wurde der Kulturüberstand der pPIC9K-KPep Transformanden für eine Reinigung des rekombinanten Enzyms mittels FPLC verwendet. Das gereinigte Enzym wies nur eine schwache spezifische Peptidaseaktivität von 159 mU L-1 im Gly-Pro p-Nitroanilid Assay auf.