Analyse der Infektiosität des Hepatitis-B-Virus des Wollaffen in vitro

Abstract

Das Ziel der Arbeit war die Analyse des zoonotischen Potentials von Woolly Monkey Hepatitis B Viren (WMHBV) über Infektionsversuche in HepG2-Zellen, die das Natrium/Taurocholat Kotransporter Polypeptid (NTCP) verschiedener Menschenaffen und Tupaia belangeri exprimierten. Weiter sollte über Kotransfektionsexperimente untersucht werden, ob aus dem humanen Hepatitis B Virus (HBV) Core und WMHBV bzw. Capuchin-monkey Hepatitis B Virus (CMHBV) Hüllproteinen chimäre Viren entstehen können. Für die WMHBV-Produktion wurde ein Expressionsplasmid bestehend aus einem pCep-Puro-Vektor und einem WMHBV-1,1mer-Überlängenkonstrukt kloniert. Anschließend wurden HepG2- und Huh7-Zellen mit diesem pCep-Puro-WMHBV-1,1mer transfiziert. In den konzentrierten Zellüberständen wurde der Virusgehalt mittels quantitativer Polymerase-Chain-Reaction (qPCR) bestimmt. Wie mittels Cäsiumchlorid-(CsCl)-Gradient nachgewiesen wurde, assemblierten das Kapsid und die Hülle bei weniger der Hälfte der Virionen zu infektiösen Partikeln. Für die Infektionsexperimente wurden HepG2-Zellen mit NTCP-Subtypen aus Neuweltaffen und Altweltaffen transfiziert und mit WMHBV infiziert. Der Nachweis der Infektion erfolgte über die immunhistochemische Markierung des Hepatitis B core und surface Antigens (HBcAg, HBsAg) sowie über einen Hepatitis B e Antigen (HBeAg)-Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Das WMHBV war in der Lage humanes, Schimpansen- und Tupaia-NTCP exprimierende Zellen nicht aber Neuweltaffen-NTCP exprimierende Zellen zu infizieren. Mit WMHBV- und CMHBV-Hüllprotein-Plasmiden und HBV-Core-Plasmiden doppelt transfizierte HepG2-Zellen sezernierten chimäre Virionen (Nachweis von HBV-DNA im Kulturüberstand). Für Analysen der chimären Virionen im CsCl-Gradienten und für Infektionsversuche war die Viruslast im Überstand der Zellkulturen zu gering. Die vorliegenden Befunde bestätigen vorangegangene Versuche, wonach in Zellkultur produzierte WMHBV Altweltaffen, nicht aber Neuweltaffen infizieren können. Weiter wurde in vitro die Möglichkeit der Entstehung chimärer Viren nachgewiesen. Dieser Befund spricht dafür, dass auch in vivo bei einer Koinfektion in vivo chimäre Viren mit neuen Eigenschaften auftreten können, die potentiell schwieriger zu behandeln sind.