Etablierung und Validierung eines Reportersystems zur Identifikation von mikro-homologer DNA-Rekombination

Abstract

Die X-chromosomale Form der Retinitis pigmentosa (XLRP) stellt aufgrund der progredienten Degeneration der Photorezeptoren mit Erblindung innerhalb der zweiten Lebensdekade eine der schwerwiegenderen Formen der RP dar und ist aktuell nicht heilbar. 80 % der die XLRP verursachenden Mutationen sind im terminalen Exon des RPGR-Gens (Retinitis pigmentosa GTPase regulator), der ORF15-Region, lokalisiert, weshalb die Korrektur der mutierten Gensequenz durch Genome Editing einen kurativen Therapieansatz bietet. Der körpereigene DNA-DSB-Reparaturmechanismus MMEJ (microhomology mediated end-joining) ist in Kombination mit hochspezifischen Endonukleasen wie CRISPR/Cas9 eine Alternative zu den bereits im Genome Editing eingesetzten HR (homologous recombination) und NHEJ (non-homologous end joining). Das Ziel dieser Doktorarbeit war die Etablierung eines Reportersystem in vitro zur Testung und Effizienzsteigerung von MMEJ, das durch den Einsatz in der ORF15-Region des RPGR-Genlokus einen kurativen Therapieansatz für die XLRP bietet. Es erfolgte die Generierung eines auf Fluoreszenz-basierenden Reportersystem für MMEJ zur Testung in HEK293-Zellen, die die RPGR-ORF15 Sequenz mit einem vorgeschalteten CMV-Promoter enthalten. Über mikrohomologe DNA-Rekombination, induziert durch das gezielte Einbringen von DSB durch CRISPR/Cas9, kann die Luziferase-Gensequenz flankiert von mikrohomologen Sequenzen (mhS), die komplementär zur RPGR-ORF15 Region sind, in das Genom integriert und durch den CMV-Promoter exprimiert werden. Es erfolgte die Messung der Luziferase-Aktivität unter Variation der Länge der mhS (10, 15, 20 und 30 bp). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Reportersystem ein wertvolles Werkzeug zur Etablierung und Validierung der Aktivität des DSB-Reparaturmechanismus MMEJ ist. Die geringere Signalaktivität bei Suppression der Ligase 3 (Schlüsselprotein von MMEJ) zeigt, das MMEJ durch das Reportersystem induziert wird. Unter Variation der Längen der mhS fand sich die höchste Luziferase-Aktivität bei 15 bp langen mhS. Durch die gezielte Suppression der konkurrierenden DSB-Reparaturmechanismen kann MMEJ favorisiert werden. Die effizienteste Suppression von NHEJ fand sich bei Knockdown der endständigen Ligase 4. Weiterführende Analysen der Knockdown-Strategien der konkurrierenden DSB-Reparaturmechanismen und die Evaluation des Reportersystems in in vivo Modellen sind erforderlich.