Effect of microbiologically active substances in powdered infant formula on the growth and detection of Cronobacter spp.

Abstract

Contaminated powered infant formula (PIF) has been identified to be linked with a number of clinical outbreaks of rare but life-threatening infections in infants associated with Cronobacter. The overall objective of this thesis is to evaluate the impact of microbiologically active substances in PIF on the growth and detection of Cronobacter spp. Depending on preparation, storage and feeding practices, a potential rapid growth of Cronobacter spp. in reconstituted PIF is possible. The first aim was to investigate the effectiveness of using hot water of 70°C or higher on inactivation of Cronobacter spp. during PIF rehydration. It was showed that PIF reconstituted with water of 80°C in plastic bottle caused a cell reduction of Cronobacter spp. of greater than 3 log and this might thus reduce substantially the risk of infection in infants. Although the effect of fermented infant formula (FIF) on suppression of Cronobacter spp. growth was shown to be partially offset by water of 80°C, this inhibitive effect based on the bioactive substances emerging after infant formula fermentation was not strong enough. It was assumed that a direct reconstitution of FIF with water of 80°C may lead to a greater inactivation of Cronobacter spp. and result in a reduction of potential infection risk in higher magnitude. Incorporation of organic acids in PIF contributes to an alternative in controlling Cronobacter growth in rehydrated PIF. The present study first reported the synergistic effect of combination of infant formula moderately acidified with organic acid to pH 6.0 and physiological infant gastric acidity of pH 5.0: Under the simulated neonatal gastric acid condition, the slightly acidified infant formula which did not show inhibitive effect solely reduced significantly the Cronobacter population. Compared with other acidification interventions reported to date where a low pH of ≤ 5.0 was achieved, the acidified formula presented in this work is expected to improve the taste due to the natural pH value and yet preserve the bacteriostatic activity.Microbiologically active substances present in infant formula product such competitive flora and/or antimicrobial components can inhibit the growth of Cronobacter and further affect the effectiveness of the detection method for Cronobacter. A new protocol for rapid detection of Cronobacter spp. from PIF and raw materials using impedance method combined with rRNA-based lateral flow assay has been evaluated, particularly on products/matrices with high amounts of competing background flora and on inhibitive specialised infant formulae. Compared with the reference method based on ISO/TS 22964, a higher sensitivity and specificity were observed, and the detection time was substantially reduced to 29 hours to obtain a final confirmation for Cronobacterin this new protocol whereas the standard protocol needs 6 days. The present work has also represented a comparative assessment of various systems including chromogenic agars, FISH, real time PCR, 16S rRNA gene sequencing, API and MALDI-TOF MS for the detection and identification of Cronobacter spp.. While the phenotypic systems based on biochemical reactions gave false positive or false negative outcomes for Cronobacter spp., the molecular-based identification systems have shown an accuracy of 100% in differentiating Cronobacter from non-Cronobacter strains. Both 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOFMS assigned isolates to species level, but the identification of MALDI-TOFMS was more discriminating and unambiguous, with results provided more rapidly within a few minutes. Cronobacter verursacht bakterielle Infektionen mit nekrotisierenden Enterokolitiden, Meningitiden und Septikämien bei Neu-und Frühgeborenen, deren Ursprung in Verbindung mit kontaminierter Säuglingsnahrung gebracht wird. Ziel dieser Arbeit war es Nachweismethoden für Cronobacter zu vergleichen,um ein möglichst schnelles und sicheres Nachweissystem zu entwickeln. Darüber hinaus sollten Substanzen identifiziert werden, die das Wachstum von Cronobacter in der Säuglingsmilchnahrung reduzieren. Der Einfluß der Zubreitung, Lagerung und Handhabung der gefertigten Milchnahrung auf das Wachstum von Cronobacter wurde untersucht. Zunächst wurde Wasser mit einer Temperatur von 70°C oder höher zur Rekonstituierung der Trockenmilch verwendet und die Überlebensrate von Cronobacter geprüft. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die Keimzahl von Cronobacter in Säuglingsnahrung, welche mit 80°C heißem Wasser in Babyflaschen aus Kunststoff zubereitet wurde, um mindestens drei Zehnerpotenzen verringerte. Somit könnte das Infektionsrisiko von Cronobacter durch die Verwendung von 80°C heißem Wasser und Kunststoffflaschen erheblich reduziert werden. Auch die mit 40°C warmen Wasser zubereitete fermentierte Säuglingsnahrung zeigte leicht reduziertes Wachstum von Cronobacter. Allerdings ist dieser Hemmungseffekt, der auf die nach der Fermentierung aufgetauchten bioaktiven Substanzen zurückzuführen ist, nicht stark genug. Es wird vermutet, dass eine Rekonstituierung der fermentierten Säuglingsnahrung mit 80°C heißem Wasser direkt zu einer stärkeren Verringerung der Keimzahl von Cronobacter führen und demzufolge das Infektionsrisiko im höheren Maße reduzieren könnte. Die Supplementierung von organischen Säuren in Säuglingsnahrung stellt somit eine Option zur Limitierung des Wachstums von Cronobacter in rekonstitutierter Säuglingsnahrung dar. Die vorliegende Arbeit ist die erste Studie, die einen synergistischen pH-Effekt zur Wachstumshemmung von Cronobacter beschreibt, der durch die Zugabe von organische Säure zur Säuglingsnahrung auf einem pH-Wert von 6,0 und der physiologischen Azidität von pH 5,0 im Säuglingsmagen berichtete. In dem simulierten Model der Säuglingsmagensäure wurde eine eindeutige Hemmwirkung gegen Cronobacter durch diese leicht angesäuerte Säuglingsnahrung gezeigt, die aber keine vollständige Inhibierung gegen das Wachstum von Cronobacter ermöglicht. Im Vergleich zu anderen Ansäuerungsinterventionen, bei denen die pH-Werte unter 5,0 erreicht wurden, ist bei der angesäuerten Säuglingsnahrung in der vorliegenden Arbeit eine Optimierung des sensorischen Geschmacks gleichzeitig ohne Verlust der Wachstumshemmung zu erwarten.Mikrobiologisch aktive Substanzen in Säuglingsnahrung, zu denen auch die kompetitive Begleitflora und antimikrobielle Komponente gehören, können das Wachstum von Cronobacter inhibieren aber zudem die Effektivität der Nachweismethoden für Cronobacter beeinträchtigen. In diesem Zusammenhang wurde eine neue Methode zum Schnellnachweis von Cronobacter mittels Impedanz-Verfahren gekoppelt mit rRNA Lateral Flow Assay etabliert, insbesondere mit Produkten und Rohmaterialen mit einer hohen Anzahl von Begleitflora sowie mit speziellen Säuglingsnahrungen mit Hemmeffekt. Gegenüber der standardisierten konventionellen Methode ISO/TS 22964 zeigte die neue Methode in dieser Arbeit eine höhere Sensitivität und Selektivität. Bei dem neuen Testverfahren ließ sich die gesamte Dauer wesentlich auf 29 Stunden verkürzen, während die klassische Methode sechs Tage brauchte, bis ein Bestätigungsergebnis für diejenige Probe, die verdächtigt positiv für Cronobacter war, vorlag.In dieser Arbeit wurden vielfältige Isolate, die zum Genus Cronobacter sowie zur nicht-Cronobacter Enterobacteriaceae-Familie gehören, vergleichend mit verschiedenen Testsystemen einschließlich chromogener Media, Fluorescenz in situ Hydridisierung (FISH), real time PCR, 16S rRNA Gensequenzierung, API und MALDI-TOFMS analysiert. Während die phänotypischen Methoden, deren Prinzipien auf biochemische Reaktionen basieren, falsch positive oder falsch negative Resultate für die Identifizierung der Cronobacter lieferten, zeigten die molekularbiologischen Identifizierungssysteme eine Genauigkeit von 100% in der Differenzierung zwischen Cronobacter und nicht-Cronobacter Isolaten. Eine Identifizierung auf Artebene war sowohl mit der 16S rRNA Gensequenzierung als auch mit der MALDI-TOFMS-Methode möglich. Im Vergleich zu 16S rRNA Gensequenzierung waren die Ergebnisse, die von der MALDI-TOFMS-Methode geliefert wurden, diskriminierender und eindeutiger. Außerdem zeichnet sich diese neue Technologie durcheinen hohen Durchsatz und eine Schnelligkeit für die Bakterienidentifizierung in wenigen Minuten aus.