Einfluss von Humanmilch-Oligosacchariden auf Selektin-vermittelte Zell-Zell-Interaktionen im Immunsystem

Abstract

Humanmilch enthält eine Vielzahl freier Oligosaccharide (5-10 g/l), die teilweise resorbiert werden und so in die systemische Zirkulation des Säuglings gelangen können. In vorausgegangenen Studien konnte gezeigt werden, dass Humanmilch-Oligosaccharide (HMO) Bindungsdeterminanten von Selektin-Liganden enthalten. Die Adhäsionsmoleküle der Selektin-Familie sind an Zell-Zell-Interaktionen des Immunsystems beteiligt. Im Rahmen einer Inflammation vermitteln Selektine das Rolling von Leukozyten auf aktivierten Endothelzellen. Durch diese Verlangsamung der Leukozyten aus dem Blutstrom wird die Leukozyten-Extravasation eingeleitet. Darüber hinaus sind Selektine an der Bildung von Thrombozyten-Granulozyten-Komplexen beteiligt, welche eine Subpopulation von hoch reaktiven Granulozyten darstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob HMO als lösliche Liganden-Analoga die Selektin-vermittelten Zell-Zell-Interaktionen des Immunsystems beeinflussen können. Oligosaccharide wurden aus Humanmilch isoliert und in eine saure und eine neutrale Fraktion getrennt. Die Oligosaccharide der sauren Fraktion enthielten Sialinsäure-Reste. Sialinsäure ist ein essentielles Strukturelement der Bindungsdeterminanten von Selektin-Liganden. Um den Einfluss der HMO auf das Rolling und die Adhäsion von Leukozyten zu untersuchen, wurden Monozyten, Lymphozyten oder Granulozyten aus humanem, peripheren Blut isoliert und in einer parallelen Durchflusskammer über humane Endothelzellen geleitet. Die Selektin-Expression wurde zuvor mit TNF-alpha induziert. Das Zellkulturmedium wurde mit verschiedenen HMO-Fraktionen oder Oligosaccharid-Standards supplementiert. In einem physiologischen Bereich zwischen 12,5 und 125 µg/ml führte die saure HMO-Fraktion zu einer konzentrationsabhängigen Reduktion des Leukozyten-Rollings um bis zu 24,0% und zu einer Reduktion der Leukozyten-Adhäsion um bis zu 52,8%. Eine Reihe von aktiven Komponenten innerhalb der sauren HMO-Fraktion konnten identifiziert werden. Die neutrale Fraktion hatte hingegen keinen Effekt. Der Einfluss der HMO auf die Bildung von Thrombozyten-Granulozyten-Komplexen in Vollblut wurde durchflusszytometrisch mit monoklonalen Antikörpern für den Thrombozyten-Marker CD42a und den Granulozyten-Aktivitätsmarker CD11b untersucht. In einem Bereich zwischen 6,25 und 125 µg/ml reduzierte die saure HMO-Fraktion nicht nur die Thrombozyten-Granulozyten-Komplexbildung um bis zu 20,3%, sondern sie führte darüber hinaus auch zu einer verminderten Granulozyten-Aktivierung um bis zu 30,5%. Auch hier zeigte die neutrale HMO-Fraktion keinen Effekt. Die Ergebnisse aus den vorliegenden Untersuchungen deuten darauf hin, dass saure HMO anti-inflammatorische Eigenschaften besitzen. Die geringere Inzidenz gestillter Säuglinge für inflammatorische Erkrankungen, wie beispielsweise der nekrotisierenden Enterocolitis, basiert möglicherweise zum Teil auf einer spezifischen protektiven Wirkung der HMO. Human milk is a rich source of a large variety of unbound oligosaccharides (5-10 g/l) partly reaching the systemic circulation of breast-fed infants. In recent studies it was shown that human milk oligosaccharides (HMO) contain binding determinants for selectins, a family of adhesion molecules involved in several cell-cell interactions in the immune system. The initial step of leukocyte extravasation at sites of inflammation is mediated by selectins leading to the rolling of leukocytes on activated endothelial cells. The formation of platelet-neutrophil complexes (PNC) is also mediated by selectins. PNC represent a subpopulation of highly activated neutrophils. The objective of this study was to determine whether or not HMO may serve as soluble selectin-ligand analogs and therefore modulate selectin-mediated cell-cell interactions. Oligosaccharides were isolated from human milk and separated into an acidic and a neutral fraction containing structures with or without sialic acid residues, respectively. Sialic acid is an essential structural component for selectin binding determinants. To investigate the influence of HMO on leukocyte rolling and adhesion, monocytes, lymphocytes, or neutrophils from human peripheral blood were passed over human endothelial cells in a parallel flow chamber. Selectin expression on endothelial cells was induced by TNF-alpha. The cell culture media were supplemented with different HMO fractions or oligosaccharide standards. In a physiological range between 12.5 and 125 µg/ml, the acidic HMO fraction inhibited leukocyte rolling up to 24.0% and leukocyte adhesion up to 52.8% in a concentration dependent manner. Several active components within the acidic HMO fraction were identified. The neutral HMO fraction had no effect. The influence of HMO on PNC formation was investigated by flow cytometry of whole blood using monoclonal antibodies for the platelet marker CD42a and the neutrophil activation marker CD11b. Within a concentration of 6.25 and 125 µg/ml, the acidic HMO fraction not only reduced PNC-formation up to 20.3% but also decreased neutrophil activation in a concentration dependent manner up to 30.5% according to CD11b-expression. The neutral HMO fraction had no effect. These results indicate that acidic oligosaccharides may serve as anti-inflammatory components of human milk and might therefore contribute to the lower incidence of inflammatory diseases such as necrotizing enterocolitis in breast-fed versus formula-fed infants.