Interaktion von Flotillinen mit Syntenin und Syndecanen bei der Entstehung von Exosomen aus Brustkrebszellen

Abstract

Exosomen sind extrazelluläre Vesikel, die an unterschiedlichen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt sind. Bei der Entstehung der Exosomen spielen verschiedene Proteine eine Rolle, z.B. die ESCRT-Komplexe, Syntenin-1, Syndecane und ALIX. Vor meiner Arbeit war bereits bekannt, dass Flotillin-1 mit ESCRTKomplexen interagiert und als exosomaler Marker dient. Ziel dieser Arbeit war es, mögliche Interaktionen von Flotillin-1 mit Syntenin-1 und Syndecanen zu untersuchen, sowie den Einfluss eines Flotillin-1-Knockouts auf die Bildung von Exosomen zu untersuchen. Hierzu wurden indirekte Pulldown-Experimente mit Fusionsproteinen, KoImmunpräzipitationen, Immunfluoreszenzfärbungen und Isolierung von Exosomen durchgeführt. Ich konnte zeigen, dass Flotillin-1 mit Syntenin-1 und dessen Teilfragmenten interagiert. Die PDZ-Domänen scheinen dabei einen wichtigeren Teil der Interaktionsdomäne zu bilden. Eine Ko-Lokalisation der Proteine zeigte sich jedoch nicht. Ebenfalls gelang der Nachweis einer Interaktion von Flotillin-1 mit allen vier Syndecanen. Hier zeigte sich zusätzlich eine Ko-Lokalisation von Flotillin-1 und Syndecan-1 im Bereich der Plasmamembran und in intrazellulären Vesikeln. Mittels CRISPR/Cas wurden Flotillin-1-Knockout-Zellen erzeugt und mittels Western Blot und Immunfluoreszenzfärbungen charakterisiert. Die Expression von Syndecan-1 wurde durch den Knockout von Flotillin-1 nicht beeinflusst, während Flotillin-2 deutlich vermindert war. Die Syntenin-1-Expression schien dagegen leicht erhöht. Exosomen wurden mit Hilfe der Ultrazentrifugation aus Wildtyp- und KO-Zellen gewonnen und verglichen. Eine Veränderung der Menge an Exosomen nach Flotillin- 1KO war nicht zu erkennen. Flotillin-1 zeigte sich jedoch auch in den Exosomen der KOZellen, obwohl es in den Zelllysaten nicht detektierbar war. Deshalb sollte die Interpretation dieses Experiments äußerst vorsichtig geschehen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten auf eine mögliche Beteiligung von Flotillin-1 bei der Bildung von Exosomen durch die nachgewiesenen Interaktionen mit Syntenin-1 und Syndecanen hin. Denkbar ist eine Veränderung der Zusammensetzung der bestimmten Exosomen, ohne eine Veränderung der ausgeschütteten oder gebildeten Menge. Hierzu sind weitere Untersuchungen jedoch nötig.