Biochemische Charakterisierung einer mesoniviralen Exoribonuklease

Abstract

Mesoniviren sind umhüllte RNA-Viren der Ordnung Nidovirales. Wie auch andere Viren dieser Ordnung kodieren Mesoniviren in ihrem Replikase-Gen eine Exoribonuklease (ExoN). Gegenstand der Arbeit war eine umfassende biochemische Charakterisierung dieses Enzyms. Dabei wurden die ExoN eines repräsentativen Mesonivirus (Cavally-Virus, CavV) und einige davon abgeleitete Enzymvarianten in Escherichia coli rekombinant hergestellt, mittels Affinitätschromatografie aufgereinigt und hinsichtlich ihrer 3'-5'-Exoribonuklease-Aktivität und Substratspezifität mit Hilfe von radioaktiv markierten RNA-Testsubstraten untersucht. Zunächst wurden die für diese Aktivität erforderlichen Reaktionsbedingungen (Salzkonzentration, pH, Temperatur, Metallionen) und die Rolle möglicher Kofaktoren bestimmt. Die rekombinant hergestellte CavV-ExoN zeigte eine Mg2+-Ionen-abhängige 3'-5'-Exoribonuklease-Aktivität in vitro. Untersuchungen von Proteinvarianten von ExoN mit Substitutionen einzelner konservierter Aminosäure-Reste der ExoN-DEEDh-Motive I, II und III durch Alanin unterstützten die vorhergesagte katalytische Rolle dieser Reste und zeigten, dass die gefundene nukleolytische Aktivität durch das heterolog exprimierte virale Protein, nicht jedoch potentiell kontaminierende bakterielle Nukleasen, vermittelt wurde. Experimente mit verschiedenen RNA-Substraten zeigten, dass doppelsträngige (ds) RNA und dsRNA mit einer terminalen Fehlpaarung die bevorzugten Substrate der CavV-ExoN darstellen. Auch dsRNA-Substrate mit internen Fehlpaarungen erwiesen sich als ausgezeichnete Substrate. Im Gegensatz dazu wurden dsRNA-Substrate mit zwei oder drei terminalen Fehlpaarungen oder auch homopolymerische einzelsträngige (ss) RNA-Substrate deutlich weniger effektiv gespalten. 3’-biotinylierte RNA-Substrate erwiesen sich als vollständig resistent gegenüber einer nukleolytischen Spaltung durch ExoN, wodurch eine mögliche Beteiligung einer endonukleolytischen Aktivität bei der Genese der beobachteten RNA-Degradationsprodukte ausgeschlossen werden konnte. In weiteren Experimenten wurden CavV-ORF1a-Proteine, die in einem ähnlichen Genomabschnitt wie das coronavirale nsp10 kodiert sind, in E. coli hergestellt, um eine mögliche ExoN-Aktivitätssteigerung durch diese Proteine zu untersuchen. Im Gegensatz zu coronaviralen ExoN/nsp10-Proteinkomplexen führte die Zugabe der CavV-ORF1a-Proteine jedoch zu keiner Stimulation der CavV-ExoN-Aktivität. Das gereinigte CavV-ExoN-Wildtyp-Protein wurde auch genutzt, um polyklonale Antikörper herzustellen, mit deren Hilfe die subzelluläre Lokalisation von ExoN in CavV-infizierten Zellen untersucht wurde. Immunfloureszenz-Untersuchungen ergaben, dass ExoN mit dem Ort der viralen RNA-Synthese im Zytoplasma infizierter Zellen kolokalisiert, was darauf hindeutet, dass die ExoN ein integraler Bestandteil des viralen Replikations-/Transkriptionskomplexes ist.