Die porcine organotypische Netzhautkultur: Optimierung der Kulturdauer und Anwendung in der gentherapeutischen Forschung

Abstract

Erbliche Retinadystrophien sind eine sehr heterogene Gruppe an Erkrankungen mit insgesamt über zwei Millionen Betroffenen und können bisher nicht geheilt werden. Durch die große Heterogenität und die sehr vielen betroffenen Gene, bietet es sich an, zur Therapie dieser Erkrankungen gentherapeutische Strategien zu erforschen. Das Auge ist für solche Methoden hervorragend geeignet, da es ein Immunprivileg besitzt und sehr gut zugänglich ist. Für die Erforschung von Gentherapien werden verschiedene Modellsysteme verwendet, um die Wirkung und eventuelle unerwünschte Reaktionen abschätzen zu können. Neben der Zellkultur und Organoiden werden hierfür in vitro organotypische Kulturen eingesetzt. Schweineaugen eignen sich dabei besonders gut, da sie anatomisch sehr nah am menschlichen Auge liegen. Ziel dieser Arbeit war es, ein porcines organotypisches Langzeit-Kulturmodell zu etablieren, an dem zukünftige gentherapeutische Ansätze getestet werden können. Zusätzlich sollten verschiedene AAVs auf ihre Transduktionseffizienz in dieser Kultur getestet werden, um einen Grundstein für den Test von AAV-vermittelten Gentherapien zu legen. Dazu wurden unterschiedliche Kulturmedien auf der Basis von Neurobasal-A-Medium getestet und die Gewebeerhaltung mit Hilfe einer eigens entwickelten Gewebequalitätspunktzahl kategorisiert. Auch wurde die Gewebeerhaltung über einen Zeitraum von 28 Tagen in regelmäßigen Abständen beurteilt, um feststellen zu können, wie lange die Retina Explantate ohne signifikante Qualitätsverlust in Kultur gehalten werden können. Die Ergebnisse zeigten, dass das Kulturmedium -+100 N-2, welches B-27 mit Insulin, L-Glutamin, Antibiotic-Antimycotic, N-2 und kein FKS bei einer Glucosekonzentration von 100 mg/dl enthielt, am besten geeignet ist, die Integrität der Retinakulturen über einen Zeitraum bis zu zwölf Tagen aufrechtzuerhalten. Sowohl Photorezeptoren als auch Stäbchen-Bipolarzellen und Zellkerne waren nach dieser Zeit gut erhalten und die Dicke von Retina und der ONL im Speziellen blieb stabil. Weitere Versuche konnten zeigen, dass die Retina Explantate mit diesem Medium bis zu zwanzig Tage sehr gut in Kultur gehalten werden konnten, aber auch nach 28 Tagen noch eine gewisse Integrität aufweisen konnten. Die Transduktionsversuche mit verschiedenen AAVs zeigten, dass es grundsätzlich möglich ist, verschiedene Zelltypen in der porcinen Retinakultur zu erreichen. Es gelang sowohl Zapfen-Photorezeptoren als auch Horizontal- und Ganglienzellen zu transduzieren, was durch grüne Fluoreszenz des exprimierten eGFP nachgewiesen werden konnte. Grundsätzlich lässt sich also resümieren, dass die porcine Retinakultur gut für die Testung von gentherapeutischen Strategien geeignet ist. Dies kann zusätzlich auch zu einer Verringerung der Versuchstierzahlen für in vivo Versuche beitragen.