Hochdurchsatz-Mutagenese von natürlichen Plasmiden mittels Recombineering

Abstract

Die weltweite Zunahme an Antibiotikaresistenzen stellt ein enormes Problem unserer Zeit dar, sodass ein Verständnis über die Resistenz-Mechanismen und ihre Verbreitungswege einen zunehmend größeren Stellenwert erlangen. Die Gründe für Antibiotikaresistenzen sind vielfältig. Durch den massiven Einsatz von Antibiotika in der Tier- und Humanmedizin werden resistente Bakterien selektioniert und die Resistenzgene unter den Bakterien ausgetauscht. Infiziert sich ein Patient mit dem entstandenen multiresistenten Erreger, bleiben oftmals nur noch sogenannte Reserveantibiotika eine Therapieoption. Eines davon ist Colistin. Dieses Antibiotikum der Gruppe der Polymyxine hat eine gute Wirksamkeit gegenüber Gram- negativen Bakterien. Vor allem bei sehr resistenten Keimen gehört es oftmals zu den einzigen verbliebenen noch wirksamen Antibiotika, da es einen anderen Wirkmechanismus als beispielsweise die Beta-Lactam-Antibiotika besitzt. Colistin interagiert mit dem Lipid A der Lipopolysaccharide der äußeren Zellmembran Gram-negativer Enterobacteriaceae und führt durch dessen Lyse zum Zelltod. Doch in den letzten Jahren wurde immer häufiger von Resistenzen auch gegenüber Colistin berichtet. Das Plasmid-lokalisierte Colistin-Resistenzgen mcr-1 kodiert für eine Phosphoethanolamin-Transferase, welche die Affinität zwischen Colistin und Lipid A verringert, sodass Colistin seine bakterizide Wirkung verliert. Trotz strenger Reglementierungen in der Nutztierzucht wurde mcr-1 in verschiedensten Isolaten mittlerweile global nachgewiesen. Dies lässt auf eine schnelle und effiziente Verbreitung der plasmidkodierten Resistenz schließen. Es ist anzunehmen, dass bestimmte genetische Erfolgsmechanismen existieren, die die Verbreitung des mcr-1-tragegendem Plasmid pV163M fördern. Um die einzelnen Gene von pV163M in Hinblick auf ihre Funktion zu untersuchen, wurden im Rahmen dieser Arbeit einzelne Gene von pV163M unabhängig voneinander deletiert. Als Verfahren wurde dazu die Lambda-Red-Rekombinase-Mutagenese angewandt, welche sich als sehr erfolgreich erwies. Es konnten im Rahmen dieser Arbeit 28 Plasmid- Deletionsmutanten hergestellt werden. Die entstandenen Mutanten wurden anschließend in Versuchen zum Wachstumsverhalten und zur Konjugationseffizienz untersucht, wobei die Mutanten Δcag12 und ΔdnaJ besonders hohe Konjugationseffizienzen, die Mutanten Δhp29 und Δhp30 auffallend niedrige Wachstumskurven aufwiesen. Diese Gene könnten demnach besondere Rollen bezüglich der Übertragung des Plasmids auf andere Bakterien beziehungsweise der regulatorischen Funktionen für das Bakterienwachstum besitzen.