Untersuchung der Auswirkungen zweier Punktmutationen im β3-Integrin auf die Immunogenität des Humanen Plättchenantigen 1a

Abstract

Fetale/neonatale Alloimmunthrombozytopenie (FNAIT) ist eine Erkrankung, bei der fetale oder neonatale Plättchen durch diaplazentar übertragene Antikörper zerstört werden. FNAIT betrifft 1 von 1500 Schwangerschaften und kann zu völlig asymptomatischen Verläufen, aber auch zu schweren Komplikationen einschließlich intrakranieller Blutungen bis hin zu fetalem Tod führen. Bislang sind die genauen Mechanismen, die zu einer Immunisierung gegen das auf den Thrombozyten vorkommende αIIbβ3 führen, noch ungenügend geklärt. Zudem steht ein verlässliches Diagnostiktool zur frühzeitigen Unterscheidung von ungefährdeten und gefährdeten Schwangerschaften bislang noch aus. In dieser Arbeit wurden zwei natürlich vorkommende Punktmutationen auf ihre Auswirkungen auf die Immunogenität des HPA-1a-Epitops untersucht. In einem ersten Teil haben wir die bei einem Patienten mit Neonataler Alloimmunthrom- bozytopenie entdeckte Punktmutation ITGB3 c.473A > G (p.Gln132Arg) daraufhin untersucht, (1) ob sie zur Bildung eines neuen Epitops auf dem Integrin αIIbβ3 führt und (2) das HPA-1a-Epitop verändert. Dafür wurde die Punktmutation in HEK-293F-Zellen eingebracht und in einem glykoproteinspezifischen antigen capture assay getestet, ob die mutationstragenden Zellen mit dem mütterlichen Serum reagieren. Es konnte festgestellt werden, dass die p.Gln132Arg-Mutation ein bisher unbekanntes Epitop bildet. Diesem wurde analog der internationalen Plättchennomenklatur die Bezeichnung Wo(a) zugeteilt. Die Mutation p.Gln132Arg verändert nicht das HPA-1a-Epitop. In einem zweiten Teil haben wir untersucht, ob die Mutation ITGB3 c.1458C > G (p.Cys460Trp), die zu einem Aminosäurenaustausch in der I-EGF-Domäne und dadurch zur Zerstörung einer Disulfidbrücke führt, das HPA-1a-Epitop verändert. Auch hier haben wir die Mutation in HEK-293F-Zellen transfiziert, das Zelllysat im Western Blot untersucht sowie anschließend mit monoklonalen anti-HPA-1a-Antikörpern unterschiedlicher Spezifität das Bindungsverhalten der Zellen in der Durchflusszytometrie getestet. Hierbei unterschied sich die Migration der Proteine im Western Blot, was auf eine Änderung der Konformation durch die Mutation p.Cys460Trp hinweist. Es bestätigte sich die Existenz zweier Subtypen von anti-HPA-1a-Antikörpern: Typ I- und Typ II-Antikörper, die sich darin unterscheiden, ob sie Zellen mit der Cys460Trp-Mutation binden und damit für eine Bindung auf die I-EGF-Domäne angewiesen sind. Die hier generierten Zellen lassen sich als Diagnostiktool einsetzen, um mütterliche Seren daraufhin zu untersuchen, ob sie Typ I- oder Typ II-anti-HPA-1a-Antikörper beinhalten. Die vorliegende Arbeit legt mit dem Nachweis unterschiedlicher Subtypen von anti-HPA-1a-Antikörpern eine mögliche Erklärung für unterschiedliche klinische Präsentationen bei identischen Antikörpertitern vor und ist ein weiterer Schritt auf dem Weg zum besserem Verständnis der Pathogenese von FNAIT. Zukünftige Studien sind notwendig, um die Auswirkungen der unterschiedlichen Antikörpersubtypen auf die Entstehung von intrakraniellen Blutungen besser zu beleuchten.