Evaluierung der Analysestrategie von Polysialinsäurekettenlängen mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie

Abstract

Polysialinsäuren setzen sich aus α2,8-verknüpften N-Acetylneuraminsäuren zusammen und kommen bei Wirbeltieren überwiegend als Modifikation des neuralen Zelladhäsionsmoleküls vor. Sowohl die Anzahl einzelner Monomere als auch ihre chemischen Verknüpfungen untereinander sind relevant für das jeweiligen Vorkommen und deren Funktionen. So sind sie beispielweise an der neuralen Zellmigration und der Myelinisierung, Axonenwachstum sowie der Synapsenbildung und an der Neurogenese beteiligt. In aktuellen Studien wurde ein starker Zusammenhang zwischen ihrer biologischen Funktion und dem Polymerisationsgrad nachgewiesen. Abhängig von ihrer Kettenlänge können sie einerseits die Zytotoxizität von Histonen, die Migration von Vorläuferzellen und Metastasen beeinflussen. Eine Abweichung ihrer Kettenlänge vom Normwert wird aktuell mit diversen Pathologien beim Menschen zusammengebracht, während ihre komplette Abwesenheit in den knock-out Mausmodellen mit der Letalität eines Organismus beschrieben ist. Die Bestimmung der PolySia-Ketten spielt, zum Verständnis ihre Funktionen sowie ihre Rolle in der heutigen Medizin, eine entscheidende Rolle. Mit den aktuell zur Verfügung stehenden Methoden ist eine tatsächliche Bestimmung der in vivo vorkommenden PolySia-Ketten nicht adäquat möglich. Unter diesen ist die DMB/HPLC-FD Methode für die Kettenlängenbestimmung am besten geeignet, hat jedoch auch relevante Nachteile. Im Rahmen der Fluoreszensmarkierung der Probe entstehen Strangbrüche, welche die Analysedaten stark beeinflussen. In der heutigen Wissenschaft der Sialinsäure-Analytik werden die genannten Strangbrüche, unter der milden Derivatisierung, eher geringgradig eingeschätzt, was zu falschen Interpretationen der Analysedaten und somit zu eingeschränkten bzw. fälschlichen Rückschlüssen bezüglich der Analyse von PolySia führen kann. Im Rahmen dieser Forschungsarbeit konnte nachgewiesen werden, dass im Rahmen der milden Derivatisierung von PolySia interne Strangbrüche, in Folge der Spaltung von α2,8-verknüpften Neu5Ac, entstehen. Zudem konnte der Nachweis erbracht werden, dass das Ausmaß der Trennungen, mit dem Polymerisationsgrad der Probe positiv korreliert. Im Gegensatz zum aktuellen Kenntnisstand, konnte aufgezeigt werden, dass die α2,3- und α2,6-Verknüpfungen an den Glykoproteinen einen minimalen und bedeutungslosen Einfluss an der Spaltung haben. Es ist vielmehr davon auszugehen, dass der größte Anteil der tatsächlichen Kettenlänge durch die aktuellen Techniken nicht erfasst werden. Die hier erlangten Ergebnisse bestätigen, dass die aktuelle Kettenlängenanalyse mittels DMB/HPLC-FD unter milden Bedingungen nicht den tatsächlichen Polymerisationsgrad widerspiegeln, sondern hauptsächlich Spaltprodukte. Die tatsächlich vorkommenden PolySia-Ketten sind nach den Ergebnissen dieser Arbeit, als viel länger anzunehmen, was bei der Diskussion über die biologischen Funktionen eine essenzielle Information darstellt.