Die Wirkung proinflammatorischer Zytokine an murinen intestinalen Organoiden

Abstract

Inflammatory bowel disease (IBD) ist eine multifaktorielle Erkrankung mit bislang nicht vollständig geklärter Pathogenese. Um die Effekte der proinflammatorischen Zytokine TNFα, IL-1β und IFNγ, welche in Blut und Gewebeproben von IBD-Patienten deutlich erhöht sind, auf das Darmepithel zu untersuchen, wurden murine Dünndarmorganoide als Modell gewählt. Histologische, immunfluoreszenzmikroskopische und funktionelle Kontrollen (Schwellung durch Sekretagoge) bestätigten die Integrität der erhaltenen Organoide. Die Inkubation mit TNFα alleine oder mit einem Zytokin-Mix aus TNFα, IL-1β und IFNγ führte zu einer Schwellung der Organoide, welche mit einer erhöhten Menge an abgestorbenen Zellmaterial im Organoidlumen einherging. Die Immunfluoreszenzfärbungen gegen aktivierte Caspase 3 zeigten eine vermehrte Apoptose nach Inkubation mit TNFα. Entgegen der initialen Vermutung, dass es in Gegenwart proinflammatorischer Zytokine zu einer verminderten Expression von abdichtenden Komponenten der Tight Junctions kommt, wurde in qPCR-Versuchen eine erhöhte Expression der abdichtenden Claudinen 3 und 4 nach 3 d Inkubation mit dem Zytokin-Mix gemessen. Die qPCR-Messungen zeigten eine signifikant erhöhte Expression des Na+-K+-2C--Cotransporters NKCC1 nach TNFα-Inkubation. Blockade des NKCC1 mit Bumetanid reduzierte die durch die Zytokine induzierte Schwellung signifikant. Indometacin, ein Hemmer von Cyclooxygenasen und damit der Produktion von Prostaglandinen, hatte keinen Einfluss auf die Zytokin-induzierte Schwellung. In Ca2+-Imaging Versuchen, in denen mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 aufgeladene Organoide mit dem Acetylcholinderivat Carbachol stimuliert wurden, hatten die Zytokine TNFα, IL-1β und IFNγ einzeln und als Zytokin-Mix sehr unterschiedliche Effekte, die zudem eine deutliche Zeitabhängigkeit aufwiesen. TNFα steigerte die Antwort auf Carbachol, ein Effekt, der nach 3 d am deutlichsten nachweisbar war. Diese stimulierende Wirkung war von der Anwesenheit von Ca2+ im Extrazellulärraum abhängig und wurde durch La3+, einen Blocker von Ca2+-permeablen Kationenkanälen in der Plasmamembran, gehemmt. Dies zeigt, dass TNFα vor allem den Ca2+-Einstrom von außen in die Epithelzellen stimuliert. Komplexer waren die Veränderungen im Ca2+-Signaling bei Exposition der Organoide mit den drei Zytokinen, wenn sie in Kombination appliziert wurden. Die basale Ca2+-Konzentration war nach längerer (≥ 3 d) Zytokinexposition erniedrigt. Da dies auch in Ca2+-freiem extrazellulärem Medium beobachtet wurde, deutet dies auf eine verminderte basale Ca2+-Freisetzung aus zellulären Speichern hin. Die Antwort auf Carbachol hingegen war mit Ausnahme eines Messpunktes (1 d Zytokinmix in Ca2+-freiem Medium) gesteigert. Die stimulierende Wirkung des Zytokinmixes auf die Carbacholantwort wurde zu mehr als 80 % durch La3+ reduziert und war verbunden mit einer (numerischen) Erhöhung des kapazitativen Ca2+-Einstroms in Ca2+-Depletions-/Repletionsexperimenten. qPCR-Messungen ergaben, dass es in Gegenwart des Zytokinmixes paradoxerweise zu einer signifikanten Herunterregulation der Expression mehrerer Komponenten der cholinergen Signaltransduktion wie dem Muskarinrezeptor vom Typ M3, der α-Untereinheit von Gq-Proteinen und der Phospholipase Cβ3 kommt. Die Verstärkung des Ca2+-Signals durch Zytokine kann also nicht durch Änderung auf Rezeptorebene oder den direkt nachgeschalteten Signalwegen zurückgehen, sondern muss sich weiter distal abspielen. Kandidaten dafür könnten Bestandteile der Kommunikation zwischen intrazellulären Speichern und der Plasmamembran sein wie dem IP3 -Rezeptor Typ 1 und dem Protein STIM2, deren Expression durch den Zytokin-Mix signifikant heraufreguliert wurde. Die Ergebnisse dieses Projekts zeigen, dass sich Organoide, trotz ihrer Einschränkungen, wie z.B. das Fehlen von mit dem Darmepithel in vivo interagierenden Zellen, wie etwa Immunzellen, enterischen Neuronen oder Fibroblasten, als Modell für entzündliche Darmerkrankungen eignen, um insbesondere die Langzeiteffekte von Zytokinen auf Epithelzellen zu untersuchen.