Nidoviren und die zu ihnen gehörenden Coronaviren (CoV) sind Positivstrang-RNA-Viren mit den größten bislang bekannten Genomen innerhalb der RNA-Viruswelt. Die charakteristische Strukturierung ihrer einzigartigen RNA-Genome ist innerhalb der Ordnung Nidovirales weithin konserviert. Bezeichnend für die Organisation nidoviraler Genome ist unter anderem die 5‘-terminale Kodierung von mehr als zehn Nichtstrukturproteinen (nsp), zu deren Translation im Verlauf der viralen Replikation die eigene genomische RNA dient. Die viralen Strukturproteine werden hingegen in der 3‘-Region des Genoms kodiert, wobei ihre Biosynthese durch einen Satz charakteristischer subgenomischer (sg)RNAs ermöglicht wird (nested set). Grundlegende Mechanismen der nidoviralen RNA-Synthesestrategie, wie Transkription, Translation und Replikation, wurden vor allem für MHV und SARS CoV erstmalig untersucht. In den Folgejahren konnten diese Erkenntnisse auf weitere Coronaviren wie SARS-CoV-2 und MERS-CoV sowie auf Vertreter anderer Familien der Ordnung Nidovirales ausgedehnt werden. Allerdings sind die molekularen Mechanismen zur Etablierung derart großer RNA-Genome beziehungsweise zur Korrektur der hohen Fehlerraten von RNA-abhängigen RNA-Polymerasen (RdRp) nicht vollständig verstanden. Im Vergleich mit anderen RNA-Viren wird angenommen, dass eine erfolgreiche Replikation derart großer RNA-Genome vermutlich durch eine Form der Fehlerkorrektur (Proofreading) unterstützt wird. Teil dieses Mechanismus bei Coronaviren ist die ExoN-Domäne des Nichtstrukturproteins nsp14 und dessen Kofaktor nsp10, die während der Replikation fehlerhaft integrierte Nukleotide der RNA-abhängigen RNA Polymerase (RdRp) entfernen kann (Liu et al., 2021; Moeller et al., 2022). Das bisherige Verständnis der nidoviralen Fehlerkorrektur und der zugrunde liegenden ExoN-Funktion beruht überwiegend auf Untersuchungen an SARS-CoV und SARS-CoV-2, weshalb in der vorliegenden Studie weitere, bislang nicht biochemisch charakterisierte ExoN-Funktionen, darunter die von WBV und HCoV-229E, systematisch analysiert und in einen vergleichenden Kontext eingeordnet wurden. Die hierbei gewonnenen biochemischen und substratspezifischen Daten zeigen erstmals übergreifende Gemeinsamkeiten zwischen unterschiedlichen nidoviralen Exonukleasen hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften, strukturellen Merkmale und potenziellen Interaktion mit dem Kofaktor nsp10.
Die gewonnenen Daten zeigen, dass die ExoN-Aktivitäten aller drei rekombinanten Proteine einzelsträngige ssRNA- sowie partiell doppelsträngige dsRNA-Substrate mit einer Länge von 22 nt effizient degradieren. Deutlich weniger effizient wurden vollständig gepaarte dsRNA-Substrate von diesen Enzymen gespalten. Lediglich für SARS-CoV-ExoN und HCoV-229E-ExoN konnte eine geringe ExoN-Restaktivität auf vollständig gepaarter dsRNA beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigte sich WBV-ExoN deutlich selektiver, sodass keine Aktivität auf vollständig gepaarter dsRNA nachweisbar war. Die effizienteste Degradierung zeigten alle drei ExoN-Domänen übereinstimmend bei Verwendung einer partiell doppelsträngigen RNA mit einem einzelnen ungepaarten Nukleotid. Dabei wurden sowohl dsRNAs mit internen als auch 3’-terminalen 1-nt-Fehlpaarungen effizient degradiert. Darüber hinaus wurde für alle drei ExoN-Domänen eine deutliche Abschwächung der Hydrolyseaktivität mit steigender Anzahl ungepaarter Nukleotide in den verwendeten dsRNA-Substraten beobachtet. Während sich WBV-ExoN bereits bei vollständig gepaarter dsRNA als selektiver erwies, war auch in diesem Fall keine nachweisbare Aktivität gegenüber RNA-Substraten mit mehr als zwei ungepaarten Nukleotiden festzustellen. Andererseits konnte für HCoV-229E- und SARS-CoV-ExoN erneut eine geringe Restaktivität gegenüber partiell doppelsträngiger RNA mit drei ungepaarten Nukleotiden nachgewiesen werden. Die ermittelten Substratpräferenzen stützen somit die Annahme, dass partiell doppelsträngige RNA mit einer einzigen Fehlpaarung das biologisch relevante Substrat nidoviraler ExoN-Aktivitäten darstellt. Die Positionierung der 1-nt-Fehlpaarung scheint dabei in Bezug auf die ermittelt hohe ExoN-Aktivität keine Rolle zu spielen. Weitere Untersuchungen unter Verwendung von 3‘-biotinylierten (blockierten) RNAs bestätigten, dass alle getesteten ExoN-Proteine ssRNA-, dsRNA- sowie partiell doppelsträngige RNA-Substrate in 3‘–5‘-Richtung degradieren, mit Ausnahme von WBV-ExoN, dass keine Aktivität auf dsRNA und partiell doppelsträngiger RNA mit mehr als zwei Fehlpaarungen am 3‘-Ende zeigte. Demzufolge ergaben sich keine experimentellen Hinweise auf eine 5‘–3‘-Exonuklease oder Endonuklease-Funktion innerhalb der untersuchten ExoN-Proteine. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass für die Hydrolyse von ssRNA nicht nur ein frei zugängliches 3‘-RNA-Ende erforderlich ist, sondern auch die C2‘-OH-Gruppe der 3‘-terminalen Ribose eine wesentliche Rolle bei der Initiation der ExoN-Aktivität spielt. Einzelsträngige RNA-Substrate mit einem C2‘-Wasserstoff (2‘-Desoxyribose-Modifizierung) wurden von den untersuchten ExoN-Aktivitäten nicht degradiert. Im Gegensatz zu früheren Untersuchungen, in denen SARS-CoV-ExoN nicht in der Lage war, 8 nt kurze ssRNA-Substrate zu degradieren, konnte in der vorliegenden Studie gezeigt werden, dass alle hier untersuchten ExoN-Domänen partiell doppelsträngige RNA-Substrate mit einer Länge von 8 nt effizient degradieren. Dabei deuten prominente, etwa 5–6 nt lange Reaktionsprodukte der ExoN-Aktivität auf eine möglicherweise minimal erforderliche ExoN/RNA-Interaktionsfläche von etwa 5–6 nt hin. Zusätzlich zeigen die ermittelten Daten erstmals für einen Vertreter der Bafiniviren (WBV) sowie für das Alphacoronavirus HCoV-229E eine durch den viralen Kofaktor nsp10/pp1aC induzierte In-vitro-Aktivitätssteigerung der ExoN-vermittelten RNA-Degradation. Der Effekt dieses Zusammenspiels bekräftigt die vermutete ExoN-Kofaktorfunktion von Coronavirus-nsp10 für die untersuchten Nidovirus-Vertreter und liefert Hinweise auf die Möglichkeit einer Koordination weiterer ORF1a-kodierter Nichtstrukturproteine im Rahmen eines Multiproteinkomplexes. Eine in diese Arbeit integrierte Mutagenesestudie konservierter Reste der ExoN-Domäne mittels Ala-Substitutionen in WBV-ExoN (D5980A, E5982A, D6082A, H6169A, D6174A) sowie den korrespondierenden Aminosäureresten in HCoV-229E-nsp14 (D5682A, E5684A, E5783A, H5859A, D5864A) untermauern die zentrale Bedeutung der ExoN Motive I–III für eine ExoN-Aktivität in vitro. Die hierbei gewonnenen Ergebnisse verdeutlichen, dass die eingefügten Ala-Substitutionen der genannten Aminosäurereste zu einer erheblichen Einschränkung der WBV- und HCoV 229E-ExoN-Aktivitäten führen. Sämtliche in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse stehen im Einklang mit einer angenommenen Korrekturlesefunktion des corona- beziehungsweise nidoviralen Replikations-Transkriptions-Komplexes und weisen zugleich auf eine zentrale Bedeutung der konservierten ExoN-Funktion im viralen Replikationszyklus hin.
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