Generierung von humanen Antikörperfragmenten für die zielgerichtete Immuntherapie der Akuten Myeloischen Leukämie

Abstract

Die Bedeutung des Einsatzes monoklonaler Antikörper (AK) zur zielgerichteten Immuntherapie sowohl benigner als auch maligner Erkrankungen nimmt durch Etablierung kostengünstiger und effektiver Techniken zur Entwicklung und Herstellung neuer AK stetig zu. Eine dieser Techniken ist die Phage Display Technologie (PD). Diese macht sich zunutze, dass Antikörperfragmente (scFv) oder Fusionsproteine, welche auf dem Genom eines Phagen codiert sind, direkt auf der Oberfläche desselben präsentiert werden. Die Analyse von Interaktionen der präsentierten Proteine mit anderen Zellen, Proteinen etc. zur Identifizierung neuer Zielstrukturen wird so erleichtert. In vorliegender Arbeit sollten mithilfe des PD Oberflächenstrukturen von Primärzellen der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) näher charakterisiert werden. Hierfür fand die wissenschaftlich etablierte scFv-PD-Bibliothek Tomlinson J Anwendung. Zunächst war eine Optimierung hinsichtlich der Selektion auf unversehrten Zellen erforderlich, so dass fünf neuartige experimentelle PD-Strategien erfolgreich etabliert werden konnten, welche Variationen bzgl. Selektion und Depletion enthielten. Eine Aufreinigung durch immunmagnetische Separation zum Erhalt hochreiner AML- Zielzellen sowie eine vorherige Depletion auf gesunden Blutspenderzellen in mittleren Antigendichten zum Abfangen unspezifischer Binder erwiesen sich dabei am vorteilhaftesten. Nach Klonierung vielversprechender Binder in ein phagenunabhängiges AK-Format (scFv-Fc) zeigten diese eine Bindung sowohl auf AML- Zellen – mit höherem Ausreifungsgrad stärker – als auch auf gesunden Monozyten. Daher sind die in dieser Arbeit selektionierten AK als AML- und monozytenspezifisch zu charakterisieren. Des Weiteren konnte eine Internalisierung von vier der getesteten AK nachgewiesen werden, so dass eine Funktionalisierung als Antikörper-Wirkstoff- Konjugat denkbar ist. Während der Sequenzierung der erhaltenen AK wurden überdies Sequenzgleichheiten zwischen einzelnen PD-Strategien festgestellt. Die Selektion gleicher Sequenzen wird in der Literatur auf dreierlei Faktoren zurückgeführt: die Amplifikation der Phagen, die Experimentierbedingungen und das Zielantigen. Bemerkenswert ist hierbei, dass einer dieser sequenzgleichen Binder unter allen selektionierten AK dieser Dissertation der stärkste und effektivste AML bindende AK war. Zusammenfassend konnte somit die PD-abhängige Generierung von humanen AK gerichtet gegen Primärzellen der AML durch Variation der Selektions- und Depletionsbedingungen erfolgreich optimiert und ein breites Spektrum an AML bindenden AK erhalten werden. Ihre Evaluation als zielgerichtetes Immuntherapeutikum verbleibt für weitere Forschung.