Homöodynamik von Redoxpotential und Glutathionstoffwechsel des Malariaerregers Plasmodium Falciparum

Abstract

Die Gefahr, die von Infektionskrankheiten ausgeht, ist aktuell so präsent wie schon lange nicht mehr. Dem Risiko einer Malaria-Infektion sind mehr als 3 Mrd. Menschen weltweit ausgesetzt. Mit jährlich mehr als 400.000 Todesfällen, hauptsächlich in Afrika, zählt die Malaria zu den tödlichsten parasitären Erkrankungen. Plasmodium falciparum als Erreger der Malaria tropica, der schwersten Form der Malaria, ist während seines intraerythrozytären Lebenszyklus oxidativem Stress unterschiedlicher Quellen ausgesetzt. Ein wichtiger Abwehrmechanismus dagegen ist sein komplexes antioxidatives Glutathionsystem. Die Untersuchung des Redox-Stoffwechsels, einschließlich des Glutathionsystems, ist von großem Interesse für das Verständnis der Biologie des Malariaparasiten, der Wirkmechanismen von Medikamenten und der Interaktionen von Wirt und Parasit. Zur Untersuchung des Glutathionredoxpotentials und dessen Veränderungen, z.B. durch Medikamente, eignen sich genetisch kodierte Fluoreszenz-basierte Redox-Sensoren (roGFPs), die bereits als leistungsfähige Werkzeuge in einigen Organismen, einschließlich Plasmodium, beschrieben wurden. Ziel dieser Arbeit war es, einen neuen Sensor, das sfroGFP2, zu untersuchen und zu charakterisieren sowie mit der bereits bekannten Sonde hGrx1-roGFP2 in vitro und in Zellkultur zu vergleichen. SfroGFP2 enthält die superfolderGFP-Mutationen (S30R, Y39N, N105T, Y145F, I171V, A206V), die Cycle-3-Mutationen (F99S, M153T, V163A) sowie die F223R-Mutation aus roTurbo. Zur Charakterisierung wurden die rekombinanten Proteine und ihre Reaktivität mit Glutathion und Malariamedikamenten untersucht sowie die Kristallstruktur von sfroGFP2 analysiert. Durch die verbesserte Fluoreszenz und die stabile Transfektion gelang es, zusätzlich zur bereits bekannten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, die Detektion mittels Plattenleser zu etablieren und damit eine schnellere und einfachere Methode mit höherem Durchsatz zu implementieren. Die Expression und Fluoreszenz von sfroGFP2 wurde über den gesamten asexuellen Lebenszyklus verfolgt. Außerdem wurde die neue sfroGFP2-Sonde mit Glutaredoxin (Grx) fusioniert und stabil in das Parasiten-Genom integriert, was die verbesserte Fluoreszenz von sfroGFP2 mit dem Vorteil, unabhängig von der vorliegenden Grx-Konzentration zu sein, kombiniert. Diese Eigenschaften sind besonders für Untersuchungen in Organellen oder kleinen Organismen von Vorteil. Eine weitere zukünftige Optimierung wären Messungen mittels Durchflusszytometrie, die den Vorteil von Single-Cell-Analyse mit Hochdurchsatz vereint. Glutathion spielt auch als posttranslationale Modifikation von Proteinen (Protein-S-Glutathionylierung) eine Rolle beim Schutz und bei der Aktivität von Proteinen. In einem SILAC-Experiment wurde die Veränderung des Glutathionyloms von P. falciparum durch oxidativen Stress untersucht und spezifische Glutathionylierungsstellen gefunden. Ein besonders interessantes Protein, das als differentiell reguliert gefunden wurde, ist das Thioredoxin (PfTrx1), das eine zentrale Rolle im antioxidativen Thioredoxinsystem hat. Da auch Kinasen, z.B. FIKK8, als glutathionylierte Proteine gefunden wurden, wirft dies die Frage auf, inwieweit posttranslationale Modifikationen miteinander im Cross Talk stehen und sich gegenseitig beeinflussen. Um erste Einblicke hierzu zu bekommen, wurde ein Pulldown mit der GFP-getaggten Casein Kinase 1 (PfCK1) unter Stressbedingungen durchgeführt und analysiert, ob sich das Interaktom im Vergleich zu ungestressten Parasiten verändert. Die ersten Daten wiesen dabei darauf hin, dass durch eine Behandlung mit Artemisinin Proteine, die an der Translation beteiligt sind, verändert werden. Weitere Untersuchungen hierzu werden notwendig sein, um detailliertere und quantitative Aussagen treffen zu können und mehr über den Cross Talk posttranslationaler Modifikationen zu lernen.