Systematische Analyse der zytokinabhängig regulierten Protein:Protein-Interaktionen von Decapping-Faktoren mittels Proximity Ligation Assays

Abstract

Processing bodies (P-bodies) sind rundliche, membranlose, zytoplasmatische Ribonukleoprotein-Strukturen, welche Decapping Komplexe, Komponenten des 5‘-3‘ mRNA-Abbaus sowie untranslatierte mRNA enthalten. Durch das Zytokin Interleukin (IL)-1 kommt es innerhalb einer Zelle zur Aktivierung einer IL-1 induzierten proinflammatorischen Signalkaskade, bestehend aus den NFκB, JNK und p38 MAP Kinase Signalwegen gefolgt von einer Reprogrammierung der Genexpression, die zur NFκB-induzierten mRNA Expression von Zytokinen (IL-6), Chemokinen (IL-8), sowie IκBα, dem negativen Regulator von NFκB, führt. In dieser Arbeit wurde durch die kürzlich in der Arbeitsgruppe etablierte Methode des Immunfluoreszenz-Proximity- Ligation-Assays untersucht, ob IL-1 einen Einfluss auf die Proteininteraktionen der Decapping Komplexe ausübt und wie diese sich zur der Anzahl an P-bodies verhalten. Es zeigte sich, dass in humanen epithelialen HeLa Karzinomzellen ein Großteil der Decapping-Faktoren in Subkomplexen außerhalb der P-bodies lokalisiert ist und nur ein sehr kleiner Teil dieser Proteine sich zu einem gegebenen Zeitpunkt in P-bodies befindet. Darüber hinaus konnte durch IL-1 mittels der PLA eine signifikante Zunahme der EDC4 Proteinexpression auf Einzelzellebene beobachtet werden. Die dimeren Interaktionen von DCP1a, DCP2, EDC4, EDC3 und XRN1 waren konstitutiv nachweisbar und bis auf die Interaktion von EDC4 und XRN1 nicht IL-1 reguliert. Dagegen führte eine Infektion der Zellen mit dem humanen Coronavirus 229E (HCoV- 229E) zu einer Reduktion der Interaktion von EDC4 und XRN1 auf Einzelzellebene. Insgesamt zeigte sich durch die Stimulation mit IL-1 keine signifikante Zunahme der P- bodies. Eine inhomogene Reaktion der HeLa-Zellen auf IL-1 fand sich auch hinsichtlich der Aktiverung des NFκB Signalwegs, da nur ca. 50-60% der Zellen eine nukleäre Translokalisation von p65 NFκB aufwiesen. Zusammenfassend zeigen diese systematischen Analysen, dass eine Reihe an Antikörper Kombinationen geeignet sind, um die verschiedenen Protein:Protein Interaktionen von P-body Komponenten auf dem endogenen Expressionslevel in einzelnen Zellen sensitiv und spezifisch nachzuweisen. Da der größte Teil dieser Komplexe ausserhalb von P-bodies lokalisiert ist, unterstützen diese Daten zudem das Modell, nach dem P-bodies Speicher- und nicht Abbauorte von mRNAs sind.