Charakterisierung von Aspartylglukosaminurie-Varianten

Abstract

Aspartylglukosaminurie (AGU) beschreibt eine autosomal-rezessiv vererbte lysosomale Speicherkrankheit, die durch eine Störung des Glykoproteinabbaus gekennzeichnet ist. Der gestörte Glykoproteinabbau wird durch eine Mutation des AGA-Gens bedingt, welche zu einer mangelnden Enzymaktivität und somit zu einer Akkumulation von Glykoasparaginen in den Lysosomen führt. Bisher sind insgesamt über 30 pathogene AGA-Varianten beschrieben worden. Der progressive, generalisierte Verlauf der Erkrankung wird durch Entwicklungsverzögerungen, psychomotorische Regression, geistige Entwicklungsstörung und verkürzte Lebenserwartung charakterisiert. Da derzeit keine Therapiemöglichkeiten für die Behandlung von Aspartylglukosaminurie zugelassen sind, besteht großer Bedarf an der Entwicklung von alternativen Therapiekonzepten. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, ein zelluläres Modell mittels Flp-In/FRT-Systems zu etablieren, welche eine langfristige, funktionelle Validierung der potentiell pathogenen AGA-Varianten ermöglicht. Durch das bessere Verständnis der molekularen Auswirkungen der verschiedenen AGA-Varianten können potentielle Therapieansätze gezielter entwickelt werden. Außerdem sollte im Zuge dieser Doktorarbeit die neuartige AGU-Mutation L126V bezüglich der AGA-Prozessierung und Enzymaktivität näher charakterisiert werden. Mithilfe des FLP/FRT-System war es möglich, konstitutiv exprimierende Zelllinien der AGA-Varianten WT, FIN-major, P28L und L126V zu generieren. Als Alternative zur Verwendung von Primärzellen aus Patienten können die stabil generierten AGA-Zelllinien zukünftig zum Wirkstoffscreening verwendet werden. Zudem kann das entwickelte Modell über die Generierung weiterer stabiler Flp-In-Zelllinien mit zusätzlichen AGA-Varianten ergänzt werden. Die funktionelle Untersuchung der neuartigen AGU-Mutation L126V bestätigte eine vollständige Prozessierung des AGA-Enzyms in die Untereinheiten. Die Transfektion von HEK-Zellen zeigte eine hohe Restaktivität. In Patientenfibroblasten wurde eine AGA-Aktivität von ca. 30% gemessen, während die Aktivitätsmessung im Serum eine Restaktivität von 34% verglichen zu einer gesunden Kontrollprobe bestätigte. Aufgrund des milden Phänotyps sollte die Sicherstellung der AGU-Diagnose über die Bestimmung der AsnGlcNAc-Ausscheidung im Urin des L126V-Patientens bestätigt werden. Durch weitere Versuche, wie die Bestimmung der zellulären Lokalisation von AGA über Immunfluoreszenz, können die pathologischen Auswirkungen des mutierten L126V-AGA weiter charakterisiert werden.