Untersuchungen zur Viabilität von Precision Cut Lung Slices von Maus und Mensch nach Kryokonservierung

Abstract

Kryokonservierung ist ein Vorgang, der es ermöglicht Zellen, Organellen und Gewebe durch die Kühlung auf sehr niedrige Temperaturen über einen längeren Zeitraum zu erhalten. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Kryokonservierung und verschiedener Einfriermedien auf Vitalität, Differenzierung und Strukturerhalt von Präzisionsschnitten (PCLS) von Lungen-gewebe zu untersuchen. Die zeitliche Limitierung der PCLS in Kultur für Studien erfordert eine Möglichkeit diese über einen längeren Zeitraum zu lagern, ohne dabei die Funktionalität zu beeinflussen. Zur Kryokonservierung wurden Medien getestet, die als Kryoprotektiva DMSO und Trehalose unterschiedlicher Konzentrationen erhielten. So konnte nach Etablierung der op-timalen Einfriermethode an murinen PCLS diese auf das humane Gewebe übertragen werden. Die Vitalität wurde anhand der LDH-Freisetzung, des MTT-Tests sowie einer Lebend-/Totflu-oreszenzfärbung bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Medium einen Einfluss auf die Vitalität ausübt, die beste Vitalität konnte mit DMEM/F-12 + 1 % Penicillin/Streptomycin + 10 % FKS + 10 % DMSO + 200 mmol/l Trehalose erzielt werden. Der Vergleich zwischen den frischen und kryokonservierten PCLS zeigte, dass sowohl die Viabilität als auch die metaboli-sche Aktivität nach Kryokonservierung reduziert war. Auch die strukturelle Intaktheit der PCLS demonstrierte eine negative Veränderung nach Kryokonservierung. Auf Proteinebene konnte jedoch keine signifikant erhöhte Expression der gespaltenen Caspase-3 festgestellt werden, die als Marker der Apoptoseinduktion eingesetzt wurde. In einem weiteren Schritt wurde die Surfactantproduktion der PCLS in Abhängigkeit der Me-dien und der Kryofixierung untersucht. Hierzu wurde eine Fluoreszenzfärbung mit LysoTracker Green sowie eine Messung der Surfactant produzierenden Proteine B und C mittels Western Blot Methodik durchgeführt. Hierbei wurde festgestellt, dass auch kryokonservierte PCLS noch differenzierte Alveolarepithelzellen Typ II besitzen und in gewissem Maße SP-B und SP-C noch nachweisbar ist, jedoch bestand eine Reduktion im Vergleich zu ungefrorenen PCLS. Die gewonnenen Ergebnisse legen dar, dass Kryokonservierung und die Langzeitlagerung von PCLS prinzipiell eine aussichtsreiche Lösung der limitierten Vitalität der PCLS in Kultur dar-stellt. Es wurde demonstriert, dass sowohl murines als auch humanes Lungengewebe vital kry-okonserviert werden kann. Allerdings erscheint es sinnvoll weitere Studien durchzuführen, um die Vitalität nach Kryokonservierung zu verbessern und die PCLS noch effektiver vor Schäden zu bewahren.