Etablierung von intrazellulären FRET-ATP-Sensoren zur Identifikation akuter Hypoxie-induzierter ATP-Veränderungen in pulmonalvaskulären Zellen

Abstract

Akute alveoläre Hypoxie führt in der Lunge innerhalb von Sekunden zu einer Vasokon-striktion der präkapillären Gefäße (Hypoxische pulmonale Vasokonstriktion, HPV), wel-che eine optimale arterielle Oxygenierung des Bluts durch Umverteilung der pulmonalen Durchblutung von schlecht in gut belüftete Alveolen sicherstellt. Eine verminderte HPV kann zu einer Hypoxämie, eine verstärkte HPV zu der Entwicklung einer pulmonalen Hypertonie (PH) beitragen. Die zellulären Signalwege und Mechanismen der HPV sind bisher nicht vollständig geklärt. Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle bei der zellulä-ren Hypoxiedetektion und Signalvermittlung, allerdings ist unklar, ob eine Hypoxie-induzierte Verminderung der mitochondrialen ATP-Produktion und daraus folgenden Veränderung der zytosolischen ATP-Konzentration bzw. des AMP/ATP Verhältnisses als Mediator beteiligt ist. Limitation in der Detektion von zeitlich und örtlich hoch aufge-lösten ATP-Veränderungen schränkten bisher die Untersuchungen ein. Ziel dieser Arbeit war es daher mit Hilfe von genetisch-codierten Fluoreszenzmarkern (CytoATeam und MitoATeam) eine Möglichkeit zu etablieren, um zeitliche und lokalisierte Veränderungen von ATP-Spiegel in glatten Gefäßmuskelzellen der Maus (mPASMCs) während akuter Hypoxie mit dem konfokalen Mikroskop zu detektieren. Diese Arbeit konnte zeigen, dass CytoATeam die erwartete Abnahme der FRET-Effizienz im Cytosol nach Inhibierung der mitochondriale ATP-Produktion zeigte, und somit zur Detektion von cytosolischen ATP-Veränderungen geeignet ist. Dagegen konnte mit MitoATeam keine Signaländerung unter inhibierter mitochondrialer ATP-Produktion detektiert werden. Unter akuter Hypoxie, die erfolgreich für Messungen unter dem konfokalen Mikroskop etabliert wurde, zeigte sich in HEK 293T Zellen ebenfalls keine signifikante Änderung der FRET-Effizienz zwischen den Zeitpunkten oder experimentellen Gruppen, weder mit den unterschiedlichen Senso-ren, noch mit Glukose-freiem oder -haltigem Zellkulturmedium. Außerdem wurde die Messung mit CytoATeam unter akuter Hypoxie erfolgreich in mPASMCs etabliert. Zusammenfassend demonstriert diese Arbeit, dass mit CytoATeam Veränderungen der ATP-Spiegel im Konfokalmikroskop gemessen werden können. Unter akuter Hypoxie konnten keine signifikanten Änderungen der Signale in HEK 293T Zellen detektiert wer-den. Weitere Untersuchungen, insbesondere nach optimierter Expression der Sensoren in primären mPASMCs, sind notwendig, um zu überprüfen, ob Änderungen des ATP/ADP-Verhältnisses unter akuter Hypoxie auftreten können.