Akute nongenomische Effekte von Corticosteron auf die Muskarin-induzierte Bronchokonstriktion bei der Maus

Abstract

Bei der Maus reagieren die kleinen luftleitenden Atemwege auf Muskarin mit einer Kontraktion. Muskarin bindet an muskarinische Acetylcholinrezeptoren, die unter physiologischen Bedingungen auf den Bronchokonstriktor Acetylcholin (ACh) reagieren. Sie finden sich auf glatten Muskelzellen und Epithelzellen.Ebenfalls auf Epithelzellen und an der glatten Muskulatur lokalisiert sind die Organischen Kationentransporter (OCTs), die nachweislich in der Lage sind Acetylcholin über die Zellmembran zu transportieren. OCTs lassen sich durch Corticosteron hemmen, wobei das Corticosteron an den OCT bindet, aber nicht transportiert wird. Ein besonderes Augenmerk liegt auf dem OCT3, für den gezeigt werden konnte, dass durch die Blockade des OCT3 mittels Corticosteron die Serotonin-induzierte Bronchokonstriktion signifikant reduziert werden konnte. OCT3 wird zudem auch als Extraneuronaler Monoamintransporter (EMT) bezeichnet, da er für die Beseitigung der Katecholamine aus dem Extrazellularraum mit zuständig ist.Weil der Atemwegswiderstand in den peripheren Atemwegen für die Pathogenese von obstruktiven Lungenerkrankungen von großer Bedeutung ist, wurde in dieser Arbeit näher untersucht, ob, und falls ja, durch welchen Mechanismus, sich die durch Muskarin induzierte Bronchokonstriktion durch Corticosteron beeinflussen lässt.Die Hypothese, dass der Einfluss des Corticosterons auf die Muskarin-induzierte Bronchokonstriktion auf die Blockade des OCT3 und einer damit verbundenen Erhöhung des Katecholaminspiegels zurückzuführen ist, da Katecholamine am beta-2-Adrenozeptoren zu einer Bronchodilatation führen, wurde über die Zugabe des Adrenozeptorantagonisten Propranolol überprüft.Zur Messung der Bronchokonstriktion kam die Methode der Videomorphometrie am Modell der vitalen Lungenschnittpräparationen (Precision-Cut Lung Slices, PCLS) zur Anwendung. An FVB-Mäusen wurde untersucht, ob Muskarin zu einer Bronchokonstriktion führt, ob diese Konstriktion durch die Zugabe von Corticosteron reduziert werden kann und ob dieser Effekt durch den beta-2-Adrenozeptorantagonisten Propranolol beeinflussbar ist.Es konnte gezeigt werden, dass Muskarin in einer Konzentration von 10 -6 M zuverlässig eine schnelle und starke initiale Kontraktion hervorrief, die über die Zeitspanne der Anwesenheit des Agonisten bestehen blieb. Das Auswaschen des Agonisten führte zu einer Dilatation der kontrahierten Bronchien, der Vorgang war demnach reversibel. Anfänglich wurde in den Versuchen ein Corticosteronpräparat verwendet, das in Ethanol gelöst vorlag. Nachdem eine eigenständige Versuchsreihe mit Ethanol einen Einfluss dieses Lösungsmittels auf die Reaktion nicht vollständig ausräumen konnte, wurde als Ersatz HBC-Komplex getestet. Hierbei wird Cyclodextrin als Lösungsvermittler für Corticosteron eingesetzt. Für Cyclodextrin konnte nachgewiesen werden, dass es keinen Einfluss auf die Reaktion nimmt. HBC-Komplex wurde somit für alle weiteren Versuche an Stelle des in Ethanol gelösten Corticosterons verwendet. Die durch Muskarin hervorgerufene Bronchokonstriktion ließ sich durch die Zugabe von Corticosteron im HBC-Komplex in einer Konzentration von 10 -4 M signifikant um 20 % reduzieren. Die Applikation von Propranolol in einer Konzentration von 10 -6 M zusätzlich zu Muskarin und Corticosteron (10 -4 M) führte zu keinem signifikanten Unterschied gegenüber der alleinigen Applikation von Muskarin und Corticosteron (10 -4 M).Die Ergebnisse zeigen, dass der akute inhibitorische Effekt von Corticosteron nicht auf die durch Serotonin hervorgerufene Bronchokonstriktion beschränkt ist, sondern sich auch auf die muskarinische Bronchokonstriktion erstreckt.Die Applikation von Propranolol führte jedoch nicht zu einer signifikanten Reduzierung des Corticosteroneffekts. Eine verlängerte Wirkphase der Katecholamine scheint demnach nicht die Ursache für den inhibitorischen Effekt des Corticosterons zu sein. Es bleibt zu prüfen, ob Corticosteron einen der beiden anderen OCTs (OCT1 und/oder OCT2) blockiert und dort eine Freisetzung von nicht-neuronalem ACh verhindert und sich daraus eine Abschwächung der Kontraktion herleitet. The peripheral airways of the mouse respond to muscarine with a constriction. Muscarine binds to muscarinic acetylcholine receptors (mAChR), whose physiological ligand is the neuronally and non-neuronally released bronchoconstrictor acetylcholine. The mAChR are localized on smooth muscle cells and epithelial cells.Organic cation transporters (OCTs) are also localized on smooth muscle cells and epithelial cells. The OCTs transport acetylcholine and they are known to be inhibited by corticosterone. Corticosterone binds to the OCT, but is not transported across the plasma membrane. Special attention is given to the isoform OCT3 since an earlier study demonstrated, that its blockade by corticosterone significantly attenuated serotonineinduced bronchoconstriction. OCT3 is also known as extra-neuronal monoamine transporter (EMT), contributing to the elimination of catecholamines from the extracellular space.Since the resistance of small peripheral airways is particularly relevant to the pathogenesis of obstructive pulmonary disease, the present study sets out to determine whether muscarinic bronchoconstriction is also inuenced by corticosterone, and if so, by which mechanism. The hypothesis that corticosterone exerts its effects via blockade of OCT3 with resulting elevation of extracellular catecholamine levels and subsequent beta-2-adrenoceptor mediated bronchodilatation was tested by use of the beta-2-adrenoceptor agonist, propranolol.Bronchoconstriction was measured by videomorphometric analysis of precision cut lung slices (PCLS) from FVB mice. In this model, it was analysed whether muscarine leads to a bronchoconstriction and whether this could be reduced by the application of corticosterone. To clarify if catecholamines are involved in a dilatatory corticosterone effect, the beta-2-adrenoceptor antagonist propranolol was employed. The experiments showed a rapid and strong initial bronchoconstriction in response to muscarine in a concentration of 10 -6 M, persisting as long as the agonist was present. Washing out the agonist led to a dilatation of the constricted bronchi, indicating the reversibility of the process.Initially, a corticosterone preparation was used that contained ethanol as solvent. In a control series of experiments, however, an effect of ethanol per se on bronchial diameter could not be excluded. Therefore, HBC-complex was tested as an alternative. This corticosterone preparation uses cyclodextrin as solvent, which did not affect the reaction in a separate series of control experiments and, therefore, was hereupon used for all further experiments.The muscarine-induced contraction was significantly reduced by 20 % by corticosterone at a concentration of 10 -4 M.The application of propranolol in a concentration of 10 -6 M in addition to muscarine and corticosterone 10 -4 M, however, had no impact an the responses of muscarine and corticosterone. The data demonstrate that the inhibitory effect of corticosterone is not restricted to serotonine-induced bronchoconstriction but also extends to muscarinic bronchoconstriction. Application of propranolol, however, did not significantly ameliorate the corticosterone effect, clearly indicating that it is not caused by prolonged catecholamine action.It remains to be elucidated whether corticosterone exerts this effect via interacting with one of the other two OCTs (OCT1 and/or OCT2), thus inhibiting release of nonneuronal acetylcholine with the consequence of a reduction of bronchoconstriction.