Involvement of activin and follistatin in the pathogenesis of chronic testicular inflammation in mice

Abstract

Experimental autoimmune epididymo-orchitis (EAEO) is a rodent model of chronic testicular inflammation that reproduces the pathology observed in some types of human infertility, characterized by elevated levels of pro-inflammatory cytokines, immune cell recruitment, germ cell loss and ultimately sub- or infertility.Activins A and B are pro-inflammatory, pro-fibrotic cytokines, but also regulate spermatogenesis and steroidogenesis under normal conditions. The roles of activin A, B and the endogenous activin antagonists, inhibin and follistatin, were examined in EAEO. The disease was induced in adult mice by immunization with syngeneic testicular homogenate.Age-matched untreated mice and controls showed no pathology, with activin A localized to Sertoli cells and interstitial macrophages. Immunized mice developed EAEO by 50 days (induction rate of 100%), and were characterized by a >50% reduction in testis weight, complete loss of germ cells, and a marked peritubular fibrotic response. Similar changes were also observed in biopsies from human testes with inflammatory infiltrates. Moreover, changes were accompanied by increased expression of key inflammatory mediators such as tumor necrosis factor, monocyte chemoattractant protein-1 and interleukin-10. An increase of the total CD45+ leukocytes, comprising CD3+ T cells, CD4+CD8- and CD4+CD25+ T cells, and a novel population of CD4+CD8+ double positive T cells was also detected in EAEO testes. Activin A and B protein levels were significantly increased in EAEO testes at 50 days, compared with untreated controls but not at 80 days, whereas the inhibin subunit mRNA levels (Inha and Inhbb) decreased in EAEO testes, becoming significantly lower after 80 days compared with control animals. Activin A receptor acvr1b and acvr2b mRNA levels were also significantly decreased in EAEO testes. In contrast, testicular follistatin levels were significantly elevated at 50 and 80 days of EAEO.These data suggest that there is a direct association between the onset of EAEO and increased activin expression. Therefore, activin may play a role in promoting inflammation and fibrosis during EAEO in mouse testis. Consequently, the development of EAEO in a mouse model with elevated circulating levels of the activin antagonist follistatin (FST), was examined. Follistatin levels were increased by a single injection of a non-replicative recombinant adenovirus-associated viral vector carrying a gene cassette of the circulating form of follistatin (FST315). Controls received an rAAV injection with an empty cassette. EAEO was induced and testes were collected 30 and 50 days after the first immunization. Serum follistatin levels were increased 5-fold in FST315 vector injected mice compared with the control group 30 days after vector injection and remained elevated until the end of the experiment. The EAEO induction rate was 40% for the FST315-vector injected group compared with 75% for the control group. Elevated levels of inflammatory mediators and activins, recruitment of immune cells, increased fibrosis, disruption of the blood-testis-barrier, and increased apoptosis were directly proportional to the observed testicular damage in EAEO.These data suggest that blocking activin activity alone, by increasing circulating follistatin levels before inducing EAEO, was not sufficient to inhibit the development of testicular inflammation and fibrosis.

Die experimentelle Autoimmun-Epididymo-Orchitis (EAEO) stellt ein Nagermodell für chronische Entzündungen des Hodens dar, das besonders in der früheren Phase der Erkrankung bestimmte Formen idiopathischer, immunologisch-bedingter Infertilität des Mannes gut reproduzieren kann. Schlüsselcharakteristika bei der EAEO und entsprechenden Erkrankungen des Mannes sind erhöhte Konzentrationen pro-inflammatorischer Zytokine, die Akkumulation von Leukocyten im Organ sowie ein Verlust von Keimzellen mit nachfolgender Sub- bzw. Infertilität. Activin A und B sind pro-inflammatorische und pro-fibrotische Zytokine, die zudem eine wichtige Funktion in der Regulation der normalen Spermatogenese und Steroidogenese aufweisen. In dieser Studie wurde eine mögliche Funktion von Activin A und B sowie der endogenen Activin-Antagonisten Inhibin und Follistatin in der Pathogenese der EAEO untersucht. Die EAEO wurde durch Immunisierung mit syngenem Hodenhomogenat in adulten Mäusen ausgelöst. Altersgleiche unbehandelte Mäuse sowie Sham-Kontrollmäuse zeigten keine pathologischen Veränderungen im Verlauf der Untersuchung, wobei Activin A immunhistochemisch in Sertoli-Zellen und interstitiellen Makrophagen gefunden wurde. Dagegen entwickelten alle immunisierten Mäuse nach 50 Tagen eine EAEO (Induktionsrate 100%) und waren durch eine mehr als 50%ige Reduktion des Hodengewichts, einem vollständigen Verlust der Keimzellen und eine deutliche fibrotische Reaktion charakterisiert. Ähnliche Veränderungen werden auch in Biopsien mit entzündlichen Infiltraten im Hoden beim Mann beobachtet. Darüber hinaus wurde die Entwicklung der EAEO durch eine erhöhte Expression entzündlicher Mediatoren wie des Tumor-Nnekrose Faktors (TNF), des Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) und von Interleukin-10 (IL-10) begleitet. Zusätzlich wurde eine starke Zunahme der gesamten CD45+ Leukozytenpopulation, die aus CD3+ T Zellen, CD4+CD8- und CD4+CD25+ T Zellen, sowie einer neuen Population von CD4+CD8+ doppelt positiven T Zellen besteht, beobachtet. Im Vergleich zu den Kontrolltieren waren die Proteinkonzentrationen von testikulärem Activin A und B Protein bei den EAEO-Tieren 50 Tage, nicht jedoch 80 Tagen, nach Induktion der EAEO deutlich erhöht. Dagegen sanken die testikulären mRNA Level der Inhibin Untereinheiten Inha und Inhb im Verlauf der EAEO und waren nach 80 Tagen deutlich niedriger als bei den Kontrolltieren. Auch die mRNA Level der Activinrezeptoren acvr1b and acvr2b waren in den EAEO Hoden deutlich reduziert, wogegen die testikulären Follistatin Konzentrationen in der EAEO-Gruppe sowohl nach 50 als auch nach 80 Tagen im Serum deutlich erhöht gemessen worden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es eine Verbindung zwischen der Entwicklung einer EAEO und erhöhter Activinexpression gibt und Activin die Entwicklung einer Hodenentzündung und fibrose während der EAEO fördern könnte. Die Rolle von Activin in der EAEO sollte anschließend in vivo in einem Mausmodell untersucht werden, in dem die Serum Follistatin-Konzentrationen experimentell durch i.m. Applikation eines nicht-replizierenden, rekombinanten adenoassoziierten Virus Vektors (rAAV), der eine Expressionskassette für die zirkulierende Follistatin Isoform (FST315) besitzt, erhöht wird. Kontrolltiere erhielten einen Vektor mit leerer Expressionskassette. Nach Induktion einer EAEO in diesen Tieren wurden die Hoden 30 und 50 Tage nach der ersten Immunisierung entnommen. Nach 30 Tagen waren die Serum Follistatin Konzentrationen bei den FST315 überexprimierenden Mäusen 5-fach erhöht und blieben es auch bis zum Ende des Experimentes. Die EAEO Induktionsrate betrug 40% für die FST315 überexprimierenden Mäuse verglichen mit 75% in der Kontrollgruppe. Erhöhte Konzentrationen an entzündlichen Schlüsselmediatoren, Activin A und B, leukocytäre Infiltrate, eine erhöhte Fibrosierung, eine beeinträchtigte Blut-Hodenschranke und vermehrte Apoptose von Keimzellen waren direkt proportional zu pathologischen Veränderungen in der Hodenmorphologie der EAEO-Gruppe.Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine alleinige Blockierung der Aktivinaktivität durch Erhöhung der Konzentration an zirkulierendem Follistatin vor und während der Induktion der EAEO, nicht ausreicht um die Entwicklung einer Hodenentzündung und fibrose vollständig zu verhindern.