CRISPR/Cas-Mismatch-Analyse unter der Verwendung von Wildtyp-SpCas9 sowie eSpCas9(1.1) als modifizierte Endonuklease zur Optimierung von Therapiemöglichkeiten im Rahmen eines Genome Editing

Abstract

Gentherapie umfasst vielversprechende Behandlungsansätze für genetische Erkrankungen, insbesondere im Bereich der Augenheilkunde. Durch das Genome Editing können genetische Sequenzen gezielt ausgeschaltet, entfernt oder korrigiert werden, was innovative Therapiemöglichkeiten eröffnet. Ein Werkzeug ist das CRISPR/Cas-System, welches eingesetzt wird, um Genmodifikationen mithilfe von sequenzspezifischen Endonukleasen wie Cas9 zu erzielen. Zentrale Problematik von CRISPR/Cas9 liegt in der Induktion von Doppelstrangbrüchen (DSBs) an nicht beabsichtigten Positionen. Diese Off Target-Aktivität geht mit Mismatches zwischen der zielbestimmenden Guide-RNA und der DNA des Genoms einher. Die vorliegende explorative Studie zielt darauf ab, CRISPR/Cas9 für das gezielte Einsetzen von DSBs zu erforschen und die Auswirkungen von Mismatches auf die Off-Target-Aktivität zu untersuchen. Dies erfolgt anhand einer Mismatch-Analyse durch den Bioluminescence Resonance Energy Transfer-Assay mithilfe von Target-Sequenzen mit Einzelpunktmutationen. Unterstützt wird das Verfahren durch Fluoreszenzmikroskopie. Ergänzend wird eSpCas9(1.1) als modifizierte Cas-Endonuklease untersucht. Die Ergebnisse zeigen Muster in Bezug auf die eingeführte Base, das resultierende Mismatch und dessen Position. WT-SpCas9 mit der Guide-Sequenz CLN3 In6G5 weist eine hohe Mismatch-Toleranz auf, insbesondere distal von der PAM-Sequenz an Position 20 und proximal an Position 1, während die Positionen 13 und 14 eine starke Vulnerabilität zeigen. Eine Spezifität von Cas9 wird sowohl durch die Seed- als auch durch die Non-Seed-Region bestimmt. Die Wobble-Basenpaarung G-T(U) zeigt die geringste Beeinträchtigung der Schneideaktivität, während C-C-Mismatches die höchste Reduktion verursachen. Ein homologer Nukleotidbasentausch hat eine geringere Auswirkung als ein heterologer. Der Einbau von Thymin oder Guanin in den Target-Strang beeinträchtigt die Schneideaktivität durchschnittlich weniger als eine andere Mutation. Die Anwendung von eSpCas9(1.1) reduziert die Off-Target-Aktivität, ohne dabei eine signifikante On-Target-Aktivität zu zeigen. Der Einsatz einer Guide-Sequenz mit einem intrinsischen Guanin an Position 20 am 5‘-Ende stellt die On-Target-Aktivität wieder her. Dies zeigt den Einfluss von Target- und Guide-Sequenzen auf verschiedene Endonukleasen. Die unterschiedliche Mismatch-Toleranz und die Bedeutung spezifischer Basenpaarungen betonen die Notwendigkeit weiterer sequenzspezifischer Mismatch-Analysen. Zukünftige Fortschritte in der CRISPR/Cas-Technologie wie modifizierte Cas9-Endonukleasen können die medizinische Anwendung erleichtern.