Funktionelle Charakterisierung der potenziell onkogenen somatischen KMT2D Stoppmutation bei kardialen Angiosarkomen

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2020

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10569

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Primäre kardiale Angiosarkome sind eine sehr seltene Gruppe von Weichteilsarkomen, die 1-2% aller Sarkomerkrankungen ausmachen. Sie sind die häufigste Entität der malignen kardialen Tumore und gehen vom Endothel der Gefäße aus. Aufgrund ihres schnellen Wachstums und der hohen Metastasierungsrate ist die Prognose für erkrankte Patienten sehr ungünstig. Zudem sind primäre kardiale Angiosarkome aufgrund ihrer Lage oft inoperabel und weisen eine hohe Resistenz gegenüber Chemotherapeutika auf. Aufgrund der Seltenheit dieser Tumore ist deren Pathogenese weitestgehend unbekannt. Bisher sind Mutationen in TP53, KRAS und CDKN2A sowie rekurrente Mutationen in KDR, PLCG1 und KMT2D bekannt. Darüber hinaus wurde bislang die Bedeutung des KDR/PLCG1 vermittelten Signalweges für die Pathogenese der kardialen Angiosarkome untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Auswirkungen der KMT2D Stoppmutationen, die vermutlich zur Inaktivierung des Gens führt, näher untersucht. Dazu wurde mit Hilfe der lentiviralen Transduktion ein stabiler KMT2D Knockdown in Endothelzellen (HUVEC) eingebracht.KMT2D ist ein chromatinmodifizierendes Protein, das die Monomethylierung von H3K4 reguliert. Mittels ATAC-Seq Analysen konnten nur geringe Effekte in den KMT2D Knockdown HUVEC auf die Chromatinstruktur ausgemacht werden. Diese Effekte wurden vor allem im intergenischen Bereich detektiert. Durch RNA-Seq Analysen wurden die KMT2D Knockdown HUVEC auf differentiell exprimierte Gene untersucht. Dabei wurden insgesamt 70 signifikant hochregulierte Gene und 63 signifikant herunterregulierte Gene detektiert. Zu den am stärksten hochregulierten Gene zählen VCAN, HAPLN1 und CLMP. Zu den am stärksten herunterregulierten Gene gehören SOX18, CLDN5 sowie NOTCH4. Eine Enriched GO-Analyse der signifikant regulierten Gene zeigte u.a. mögliche Effekte auf den Aufbau der extrazellulären Matrix, das Zellwachstum, die Angiogenese sowie die Zellmigration.Die in den KMT2D defizienten HUVEC stark hochregulierten Gene VCAN, COL1A2 und HAPLN1 sind Liganden für Intergine wodurch der Integrin Signalweg aktiviert werden kann. Es zeigte sich eine dauerhaft signifikante Zunahme der relativen Menge an phosphoryliertem FAK, ein wichtiges Signalmolekül im Integrin Signalweg, sowie an phosphorylierter MAPK in den KMT2D defizienten HUVEC. Zusätzlich konnten Veränderungen des Aktinzytoskeletts detektiert werden. Es konnte sowohl eine Veränderte F-Aktin Verteilung in der Zelle als auch ein verändertes, weniger flächendeckendes Zellwachstum mit spitzeren Zellfortsätzen beobachtet werden. Auch sich übereinander lagernde Zellen konnte in den shRNA transduzierten HUVEC deutlich häufiger beobachtet werden. Veränderungen in biologischen Prozessen konnten ebenfalls in den KMT2D Knockdown HUVEC detektiert werden. So zeigte sich in den KMT2D defizienten HUVEC eine deutliche Reduktion der Zellproliferation. Auch einen tendenziellen Anstieg der Zellen, die sich in der Sub-G1- bzw. G1-Phase befanden,konnte in den KMT2D Knockdown HUVEC beobachtet werden. Allerdings zeigten die Knockdown Zellen keine signifikanten Veränderungen der Apoptoseresistenz. Des Weiteren wurde deutlich, dass die KMT2D Knockdown HUVEC im Vergleich zu den nsc transduzierten HUVEC eine erhöhte Invasivität hatten, das Migrationsverhalten der Zellen aber nicht verändert war.Insgesamt wurde deutlich, dass in KMT2D Knockdown HUVEC der Integrin Signalweg beeinflusst ist, wodurch sich das Zellwachstum verändert und die transformierenden Eigenschaften und dadurch die Entstehung der kardialen Angiosarkome begünstigt werden könnten. So könnte durch die strukturellen Veränderungen des F-Aktin Zytoskeletts, der verstärkten Invasion und der Überlagerung der Zellen die Angiogenese der endothelialen Zellen gefördert werden.

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