Endotheliales NO steigert die Sekretion der inflammatorischen Prostaglandine PGE2 und PGI2 aus Typ2-Zellen der Lunge in einem Ko-Kultur-Modell in vitro

Abstract

Das 'Acute Respiratory Distress Syndrome' ( ARDS ) ist ein häufig vorkommendes und schwer verlaufendes Krankheitsbild mit vielfältigen Ursachen. Hauptschädigungsort ist die sogenannte alveolo-kapilläre Membran der Lungen, bestehend aus den Alveolarepithelzellen Typ1 und Typ2 ( Typ1-Zellen und Typ2-Zellen ) sowie den mikrovaskulären Endothelzellen. Im Verlauf dieser Erkrankung kommt es zu einem Gefügeverlust des kapillären Endothels und des alveolären Epithels mit darauffolgendem interstitiellem wie alveolärem Lungenödem. Desweiteren hat es eine Infiltration mit Entzündungszellen und die Freisetzung verschiedenster Mediatoren zur Folge. Dies führt zu den typischen klinischen Merkmalen des ARDS mit Gasaustauschstörung und pulmonal-vaskulärer Widerstandserhöhung. Viele Arbeiten sind bekannt, in welchen die Auswirkungen des ARDS auf die alveolo-kapilläre Membran an in vivo-Modellen, beispielsweise an isolierten Lungen- oder Ganztiermodellen, untersucht worden sind. Es existieren jedoch wenige Arbeiten bei denen ein in vitro-System zur Darstellung dieser Membran verwendet worden ist.Widerstandserhöhung. Ziel dieser Arbeit war es, die alveolo-kapilläre Membran als in vitro-Modell aus Typ2-Zellen sowie aus humanen mikrovaskulären Endothelzellen der Lunge ( HLMEC ) zu etablieren und auf die im Rahmen des ARDS vermehrt freigesetzten Parameter PGE2, PGI2 und VEGF im Vergleich zu den mono-kultivierten Typ2-Zellen und HLMEC zu untersuchen. Darüber hinaus sollte die Entwicklung des elektrischen Widerstandes, der als Marker für die Dedifferenzierung von Typ2-Zellen in Typ1-Zellen angesehen wird, in dem Ko-Kultur-Modell mit den mono-kultivierten Zellen verglichen werden.Widerstandserhöhung. Für das Ko-Kultur-Modell wurden zunächst die HLMEC auf die eine Seite einer Transwellmembran ausgesät, und, nach erfolgter Adhärenz dieser Zellen, auf der anderen Seite der Membran die Typ2-Zellen aufgebracht. Zum Vergleich dienten Typ2-Zellen und HLMEC, die jeweils alleine auf einem Transwell kultiviert wurden.Widerstandserhöhung. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass es bei der Ko-Kultur aus Typ2-Zellen und HLMEC zu einer gesteigerten PGE2- und PGI2-Synthese kommt. Innerhalb von 48 Stunden konnte dort das Doppelte der PGE2- bzw. PGI2-Werte im Vergleich zu den mono-kultivierten Kontrollen nachgewiesen werden. Dies konnte sowohl an einem rein humanen System aus Typ2-Zellen und HLMEC als auch anhand eines Modells aus Typ2-Zellen der Ratte und HLMEC gezeigt werden.Hinsichtlich der erhöhten Freisetzung von PGE2 und PGI2 in der Ko-Kultur ergaben weitere Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit, dass die gesteigerte Synthese Cox-2-abhängig ist. Auch konnte gezeigt werden, dass es für die gesteigerte Freisetzung des direkten Zellkontaktes bedarf, und dass sich die erhöhte Synthese dieser beiden Prostaglandine nicht mehr nachweisen lässt, wenn die beiden Zelltypen in einem gewissen Abstand voneinander kultiviert wurden.Als möglicher Mediator, der diese gesteigerte Synthese vermittelt, wurde im Verlaufe dieser Arbeit Stickstoffmonoxid ( NO ) herausgearbeitet. Nach Hemmung der endothelialen NO-Synthase durch Präinkubation der HLMEC mit dem NO-Synthase-Hemmer L-NMMA ist es zu keiner Steigerung der PGE2- und PGI2-Freisetzung mehr gekommen. Die gemessenen Werte bewegten sich auf dem Niveau der mono-kultivierten Typ2-Zellen. Desweiteren war es möglich, die Synthese dieser beiden Prostaglandine durch die Inkubation von mono-kultivierten Typ2-Zellen mit dem NO-Donator Spermine NONOate sowie der NO-Vorstufe L-Arginin um bis zu 100 % zu steigern.Widerstandserhöhung. Bei der Messung der Werte für VEGF stellte sich heraus, dass sich im Ko-Kultur-System nur noch die Hälfte der VEGF-Konzentrationen im Vergleich zu den einzeln kultivierten Zellen nachweisen ließen. Weitere Untersuchungen ergaben hinsichtlich der gemessenen VEGF-Werte jedoch, dass das von den Typ2-Zellen gebildete VEGF wahrscheinlich an den HLMEC gebunden wird und damit nicht mehr im Medium nachweisbar ist.Widerstandserhöhung. Bei der Messung des elektrischen Widerstandes zeigte sich, dass der Widerstand im Ko-Kultur-System im gesamten Messzeitraum um über 100 % niedriger war als bei den mono-kultivierten Zellen. Daraus lässt sich ableiten, dass die Ko-Kultur mit HLMEC der Dedifferenzierung der Typ2- zu Typ1-Zellen entgegenwirkt.Widerstandserhöhung. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass die gesteigerte Synthese der beiden Prostaglandine PGE2 und PGI2 im Ko-Kultur-Modell durch den aus mikrovaskulären pulmonalen Endothelzellen freigesetzten Mediator NO bedingt ist. Stickstoffmonoxid gelangt hierbei zu den Typ2-Zellen und führt dort zu einer Hochregulierung der Cox-2. Dies wiederum steigert die Produktion dieser beiden Prostaglandine. Widerstandserhöhung. Der Grund für die erniedrigten VEGF-Werte während der Ko-Kultur scheint durch eine Bindung von VEGF an die HLMEC bedingt zu sein, da es nach Inkubation nicht mehr im Kulturmedium nachweisbar ist.Widerstandserhöhung. Die gewonnenen Erkenntnisse über die signifikant niedrigeren Widerstände in der entwickelten Ko-Kultur im Vergleich zu den mono-kultivierten Typ2-Zellen können ein Hinweis auf eine spätere Dedifferenzierung von Typ2-Zellen in Typ1-Zellen sein. Hierfür spricht, dass ein Anstieg des elektrischen Widerstandes als Marker für die Entwicklung zu Typ1-Zellen gilt. The 'Acute Respiratory Distress Syndrome' (ARDS) is a frequent and often fatal disease with a variety of causes. The main site of damage is the so-called alveolocapillary membrane of the lung, consisting of alveolar epithelial cells type1 and type2 (type1 cells and type2 cells) and microvascular endothelial cells. In the course of the disease there is a loss of intercellular adhesion of the capillary endothelium and the alveolar epithelium followed by interstitial and alveolar pulmonary edema. It also leads to infiltration by inflammatory cells and mediators.Widerstandserhöhung. The consequences are the typical clinical characteristics of ARDS with disturbed respiratory exchange and enhanced pulmonary-arterial resistance. Many studies have dealt with the effects of ARDS on the alveolocapillary membrane in in vivo models, but there are only few studies have used an in vitro model to characterise this membrane.Widerstandserhöhung. The aim of this study was to establish an alveolocapillary membrane in vitro (consisting of type2 cells and human lung microvascular endothelial cells (HLMEC)) and to analyse the factors PGE2, PGI2 and VEGF which are liberated in the course of ARDS in comparison to mono-cultivated type2 cells and HLMEC.A further aim was to compare the development of the electrical resistance, which is a marker of the dedifferentiation of type2 cells to type1 cells, between the co-culture model and the mono-cultivated cells.Widerstandserhöhung. For the co-culture model HLMEC were first placed on the lower surface of an inverted transwell membrane. After they reached adherence the type2 cells were placed on the other side of the membrane. Mono-cultivated cells were used for comparison.Widerstandserhöhung. The results of this study revealed an increased synthesis of PGE2 and PGI2 in the co-culture model. Within 48 hours twice as much PGE2 and PGI2 was detected as in the mono-cultivated cells. This was shown in a pure human system consisting of type2 cells and HLMEC as well as in a model consisting of rat type2 cells and HLMEC.Widerstandserhöhung. The enhanced release of PGE2 and PGI2 in the established co-culture model proved to be cox-2 dependent. It was also shown that the cells require direct cell contact for the enhanced synthesis. No enhancement was detected when the cells were cultured at a distance from each other.Widerstandserhöhung. Nitric oxide (NO) was shown to be a possible mediator of this increased synthesis. After the inhibition of endothelial NO synthase by preincubating the HLMEC with the L-arginine antagonist L-NMMA no enhancement of the PGE2 and PGI2 synthesis was seen. Furthermore it was possible to increase the PGE2 and PGI2 production by up to 100% by incubating mono-cultivated type2-cells with the NO donor SpermineNONOate and L-arginine.Widerstandserhöhung. During the measurements of VEGF it become apparent that only half of the VEGF concentration was detected in the co-culture model in comparison with the mono-cultivated cells. However, further investigations revealed that VEGF produced by type2 cells is bound by the HLMEC and therefore could not be detected in the cell-culture supernatant. Widerstandserhöhung. Measurement of the electrical resistance showed that the resistance in the co-culture model was 100% lower than in the mono-cultivated type2 cells. These results indicate that co-cultivation with HLMEC counteracts the dedifferentiation from type2 to type1 cells.Widerstandserhöhung. The results of this study showed that the enhanced synthesis of both prostaglandins PGE2 and PGI2 in the co-culture model is caused by NO released by microvascular pulmonary endothelial cells. Nitric oxide reaches the type2 cells and results in an upregulation of cox-2. This enhances the production of both prostaglandins.Widerstandserhöhung. The reduced VEGF concentration during co-culture appears to be due to the effect of binding of this mediator by the HLMEC.The significantly lower resistance in the co-culture model in comparison to the mono-cultivated type2 cells could be seen as an indication of a later dedifferentiation from type2 cells to type1 cells, because augmentation of the electrical resistance is a marker of the differentiation to type1 cells.