Endotheliales NO steigert die Sekretion der inflammatorischen Prostaglandine PGE2 und PGI2 aus Typ2-Zellen der Lunge in einem Ko-Kultur-Modell in vitro
Das 'Acute Respiratory Distress Syndrome' ( ARDS ) ist ein häufig vorkommendes und schwer verlaufendes Krankheitsbild mit vielfältigen Ursachen. Hauptschädigungsort ist die sogenannte alveolo-kapilläre Membran der Lungen, bestehend aus den Alveolarepithelzellen Typ1 und Typ2 ( Typ1-Zellen und Typ2-Zellen ) sowie den mikrovaskulären Endothelzellen. Im Verlauf dieser Erkrankung kommt es zu einem Gefügeverlust des kapillären Endothels und des alveolären Epithels mit darauffolgendem interstitiellem wie alveolärem Lungenödem. Desweiteren hat es eine Infiltration mit Entzündungszellen und die Freisetzung verschiedenster Mediatoren zur Folge. Dies führt zu den typischen klinischen Merkmalen des ARDS mit Gasaustauschstörung und pulmonal-vaskulärer Widerstandserhöhung.
Viele Arbeiten sind bekannt, in welchen die Auswirkungen des ARDS auf die alveolo-kapilläre Membran an in vivo-Modellen, beispielsweise an isolierten Lungen- oder Ganztiermodellen, untersucht worden sind. Es existieren jedoch wenige Arbeiten bei denen ein in vitro-System zur Darstellung dieser Membran verwendet worden ist.Widerstandserhöhung.
Ziel dieser Arbeit war es, die alveolo-kapilläre Membran als in vitro-Modell aus Typ2-Zellen sowie aus humanen mikrovaskulären Endothelzellen der Lunge ( HLMEC ) zu etablieren und auf die im Rahmen des ARDS vermehrt freigesetzten Parameter PGE2, PGI2 und VEGF im Vergleich zu den mono-kultivierten Typ2-Zellen und HLMEC zu untersuchen. Darüber hinaus sollte die Entwicklung des elektrischen Widerstandes, der als Marker für die Dedifferenzierung von Typ2-Zellen in Typ1-Zellen angesehen wird, in dem Ko-Kultur-Modell mit den mono-kultivierten Zellen verglichen werden.Widerstandserhöhung.
Für das Ko-Kultur-Modell wurden zunächst die HLMEC auf die eine Seite einer Transwellmembran ausgesät, und, nach erfolgter Adhärenz dieser Zellen, auf der anderen Seite der Membran die Typ2-Zellen aufgebracht. Zum Vergleich dienten Typ2-Zellen und HLMEC, die jeweils alleine auf einem Transwell kultiviert wurden.Widerstandserhöhung.
Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass es bei der Ko-Kultur aus Typ2-Zellen und HLMEC zu einer gesteigerten PGE2- und PGI2-Synthese kommt. Innerhalb von 48 Stunden konnte dort das Doppelte der PGE2- bzw. PGI2-Werte im Vergleich zu den mono-kultivierten Kontrollen nachgewiesen werden. Dies konnte sowohl an einem rein humanen System aus Typ2-Zellen und HLMEC als auch anhand eines Modells aus Typ2-Zellen der Ratte und HLMEC gezeigt werden.Hinsichtlich der erhöhten Freisetzung von PGE2 und PGI2 in der Ko-Kultur ergaben weitere Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit, dass die gesteigerte Synthese Cox-2-abhängig ist. Auch konnte gezeigt werden, dass es für die gesteigerte Freisetzung des direkten Zellkontaktes bedarf, und dass sich die erhöhte Synthese dieser beiden Prostaglandine nicht mehr nachweisen lässt, wenn die beiden Zelltypen in einem gewissen Abstand voneinander kultiviert wurden.Als möglicher Mediator, der diese gesteigerte Synthese vermittelt, wurde im Verlaufe dieser Arbeit Stickstoffmonoxid ( NO ) herausgearbeitet. Nach Hemmung der endothelialen NO-Synthase durch Präinkubation der HLMEC mit dem NO-Synthase-Hemmer L-NMMA ist es zu keiner Steigerung der PGE2- und PGI2-Freisetzung mehr gekommen. Die gemessenen Werte bewegten sich auf dem Niveau der mono-kultivierten Typ2-Zellen. Desweiteren war es möglich, die Synthese dieser beiden Prostaglandine durch die Inkubation von mono-kultivierten Typ2-Zellen mit dem NO-Donator Spermine NONOate sowie der NO-Vorstufe L-Arginin um bis zu 100 % zu steigern.Widerstandserhöhung.
Bei der Messung der Werte für VEGF stellte sich heraus, dass sich im Ko-Kultur-System nur noch die Hälfte der VEGF-Konzentrationen im Vergleich zu den einzeln kultivierten Zellen nachweisen ließen. Weitere Untersuchungen ergaben hinsichtlich der gemessenen VEGF-Werte jedoch, dass das von den Typ2-Zellen gebildete VEGF wahrscheinlich an den HLMEC gebunden wird und damit nicht mehr im Medium nachweisbar ist.Widerstandserhöhung.
Bei der Messung des elektrischen Widerstandes zeigte sich, dass der Widerstand im Ko-Kultur-System im gesamten Messzeitraum um über 100 % niedriger war als bei den mono-kultivierten Zellen. Daraus lässt sich ableiten, dass die Ko-Kultur mit HLMEC der Dedifferenzierung der Typ2- zu Typ1-Zellen entgegenwirkt.Widerstandserhöhung.
Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass die gesteigerte Synthese der beiden Prostaglandine PGE2 und PGI2 im Ko-Kultur-Modell durch den aus mikrovaskulären pulmonalen Endothelzellen freigesetzten Mediator NO bedingt ist. Stickstoffmonoxid gelangt hierbei zu den Typ2-Zellen und führt dort zu einer Hochregulierung der Cox-2. Dies wiederum steigert die Produktion dieser beiden Prostaglandine. Widerstandserhöhung.
Der Grund für die erniedrigten VEGF-Werte während der Ko-Kultur scheint durch eine Bindung von VEGF an die HLMEC bedingt zu sein, da es nach Inkubation nicht mehr im Kulturmedium nachweisbar ist.Widerstandserhöhung.
Die gewonnenen Erkenntnisse über die signifikant niedrigeren Widerstände in der entwickelten Ko-Kultur im Vergleich zu den mono-kultivierten Typ2-Zellen können ein Hinweis auf eine spätere Dedifferenzierung von Typ2-Zellen in Typ1-Zellen sein. Hierfür spricht, dass ein Anstieg des elektrischen Widerstandes als Marker für die Entwicklung zu Typ1-Zellen gilt.
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