Charakterisierung kolorektaler Tumorzellen nach stabiler Transfektion mit Matrix-Metalloproteinase-9 und der MMP-9-Hämopexindomäne

Abstract

Das kolorektale Karzinom (KRK) ist der dritthäufigste maligne Tumor der westlichen Welt. Durch verschiedene Mutationen in Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen entsteht durch die sogenannte Adenom-Karzinom-Sequenz aus gesundem Gewebe ein Kolonkarzinom. Die extrazelluläre Matrix (EZM) ist einer der wichtigsten Regulatoren der Zell- und Gewe-befunktion. Ein wesentlicher Bestandteil der EZM sind die Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Diese spielen insbesondere beim Gewebeumbau eine wichtige Rolle. Derzeit sind über 23 MMPs bekannt. Sie werden durch die Tumorzellen selbst oder vom umliegenden Gewebe produziert und sind bedeutsam für die Entstehung, Invasivität und Metastasierung von malignen Zellen. Beim kolorektalen Karzinom sind vor allem die Gelatinasen (MMP-9 und MMP-2) involviert. MMP-9 kommt im kolorektalen Karzinom und dessen Umgebung vor und besteht aus einem Signalpeptid, einem Propeptid, einem katalytischen Zentrum, einer Fibronektin Typ II Domäne, der Hinge-Region und einer Hämopexin-ähnlichen Do-mäne (PEX). Die Hämopexindomäne hat die Form eines vierblättrigen Propellers und regu-liert die Substratbindung. Versuche, unspezifische Breitband-Inhibitoren der MMPs zu ge-nerieren, zeigten in klinischen Studien keinen Benefit. Jedoch konnte in der Vergangenheit gezeigt werden, dass die Hämopexindomäne von MMP-9 (PEX-9) die Invasivität und An-giogenese von Glioblastomzellen hemmt und die Zellmigration von malignen Melanomzel-len reduziert. Ergebnisse, die das kolorektale Karzinom und KRK-Zellen betreffen, fehlten bislang.In dieser Dissertation wurden Doxycyclin-induzierbare kolorektale Zelllinien (SW-620) stabil transfiziert. Durch die Doxycyclin-induzierbare Expression von MMP-9 und PEX-9 in diesen Zellen wurde eine Basis für weitere Untersuchungen in vivo geschaffen. MMP-9 und PEX-9 wurden zunächst in den Vektor pLVX-TRE3G-ZsGreen1 kloniert. Die Expres-sion der Konstrukte in Zellen wurde erfolgreich auf RNA- und Proteinebene verifiziert. Die transgenen Zellen wurden im Rahmen eines proof of principle Nacktmäusen injiziert und bildeten allesamt Tumore aus. Die erfolgreiche Etablierung der transgenen Zellen liefert die Grundlage für weitere in vivo Analysen zur Tumorentstehung und der darin involvierten Signalwege. Inwiefern PEX-9 die Angiogenese, das Tumorwachstum, die Invasivität und die Metastasierung des kolorektalen Karzinoms in vivo beeinflusst, wird in laufenden Nacktmausmodellen untersucht. Hieraus können Möglichkeiten für neue antitumorale The-rapien entwickelt werden. In vitro wurden Unterschiede zwischen MMP-9 und PEX-9 transgenen Zellen untersucht. Im Phosphokinase-Array zeigte sich eine deutlich schwächere Phosphorylierung von eNOS und Akt nach MMP-9-Induktion. Bei der Kontrolle auf Protein- und RNA-Ebene konnten weitere Unterschiede nachgewiesen werden. VEGF wurde vermindert exprimiert und MYB vermehrt. Die verminderte Phosphorylierung von eNOS kann Tumorwachstum redu-zieren und eine geringere Menge an VEGF kann zu einer Reduktion der Angiogenese füh-ren. MYB verhindert die Zelldifferenzierung in Kolonzellen und die Apoptose der Karzi-nomzellen. Die Bedeutung dieser in vitro Erkenntnisse ist in weiteren Zell- und Mausversu-chen zu spezifizieren.

The colorectal carcinoma is the third-most common malignant tumor in the western world. A colon carcinoma develops from healthy tissue through the so called adenoma carcinoma sequence by mutations taking place in oncogenes or tumorsuppressorgenes. The extracellular matrix (ECM) is one of the most important regulators of the cell and tissue function. Matrix metalloproteinases (MMPs), which are essential components of the ECM, play a key role particularly within the tissue rebuilding process. Currently, more than 23 matrix metallopro-teinases are known. They have a leading impact in tumorgenesis, invasivity and metastatic spread due to their production in the tumor cells and the surrounding tissue. The gelatinases (MMP-9 and MMP-2) are especially involved in the genesis of the colorectal carcinoma. MMP-9 is found in the colorectal carcinoma and its surroundings and consists of a signal-peptid, a propeptid, a catalytic centre, a fibronectin type II domain, the hinge-region and a hemopexin-like domain (PEX). The hemopexin domain is shaped like a four-bladed propel-ler and regulates the substrate connection. Attempts to generate unspecific broadband inhi-bitors of the MMPs proved unsuccessful in clinical studies. However, it could be shown, that PEX-9 inhibits invasivity and angiogenesis of glioblastoma cells and reduces migration of malignant melanoma cells. Results concerning the colorectal carcinoma and CRC cells were missing.Doxycycline-induced colorectal cell lines (SW-620) were stable transfected as part of this work. A base for further in vivo research could thus be laid by stably expression MMP-9 and PEX-9. MMP-9 and PEX-9 were cloned in the vector pLVX-TRE3G-ZsGreen1. The ex-pression was controlled successfully at RNA and protein levels. In further in vivo experi-ments, the transgenic cells could be injected in nude-mice, all of which developed tumors. The successful establishment of transgenic cells lays the foundation for further in vivo exa-minations of tumor genesis and pathways involved. The extent of PEX-9 effects on angio-genesis, tumor growth, invasivity and metastatic spread in vivo is subject of mouse models currently conducted. New possibilities for anti-tumoral therapies could be derived from these models. In a second step, the differences between MMP-9 and PEX-9 transgenic cells were exa-mined in vitro. The phosphokinase-array showed a notably weaker phosphorylation of e-NOS and Akt showed in MMP-9 induction. Review at protein and RNA level revealed even more differences. VEGF was also expressed in reduced amount, while MYB was in-creased. Diminished phosphorylation of eNOS may reduce tumorgrowth. Lower amount of VEGF leads to a reduction in angiogenesis. MYB prevents cell differentiation in colorectal cells and apoptosis of the carcinoma cells. The meaning and significance of this in vitro as-saying are to be specified in additional cell and mouse experiments.