Methodenoptimierung für den automatisierten "On-Membrane-Digest" nach Western Blot
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Zusammenfassung
Ein wichtiger Bestandteil der Proteomik ist die Identifizierung exprimierter Proteine und dieAnalyse der Proteome von Zellen, Organellen und ganzen Organismen. Diese Methodenwerden z.B. bei der Untersuchung von Krankheitserregern oder pathologischenVeränderungen in der medizinischen Forschung eingesetzt.Die 2D-Gelelektrophorese mit anschließendem In-Gel-Verdau in Kombination mit derMassenspektrometrie stellt neben LC-basierenden Methoden eine der bisher bestenMöglichkeiten dar, Proteine zuverlässig zu identifizieren.In dieser Arbeit wurde eine automatisierte Methode entwickelt, nach der 2DGelelektrophoreseund dem Transfer der Proteine auf NC- bzw. PVDF-Membranen denproteolytischen Verdau auf der Blot-Membran zu ermöglichen.Zur Detektion der Proteine auf den Membranen wurden diese mit dem Farbstoff Direct Blue71 angefärbt. Anschließend konnten die Spots aus den Membranen ausgeschnitten und demautomatisierten Verdau zugeführt werden. Ein Großteil dieser Arbeit bestand darin, denautomatischen On-Membrane-Verdau hinsichtlich der nachfolgendenmassenspektrometrischen Identifizierung der Proteine durch Peptide-Mass-Fingerprint-Analysen zu optimieren, indem Parameter wie Verdauzeit, Zusammensetzung derExtraktionslösung, Zugabe von Octylglycosid zu den Verdaupuffern und Trypsinmengevariiert wurden.Diese Methode wurde dann für die Analyse von Proteinen nach vorangegangenem WesternBlot und Immunodetektion per ECL weiterentwickelt. Hier war die Entwicklung einereffizienten Waschmethode zur Entfernung des Blockierungsreagenzes Roti-Block vonentscheidender Bedeutung.Nach dem automatischen Verdau wurden die Verdauextrakte nach geeigneterMatrixpräparation auf einen MS-Probenträger aufgetragen und der MS-Analyse zugeführt. Indiesem Teil der Arbeit wurden die Proteinidentifizierungen mittels dreier verschiedenerMatrices verglichen: HCCA-Matrix nach Jahn, DHB/HCCA-Mischmatrix und DHB/H3PO4-Matrix. Hierbei stellte sich heraus, daß Matrices unterschiedlich stark auf Kontaminationenaus dem Western-Blot Prozess reagieren. So stört das Blockierungsreagenz Roti-Block dieMessung mit HCCA-haltigen Matrices erheblich.Die Entwicklung dieser automatisierten Verdaumethode direkt von Western Blot-Membranenermöglicht nun mit minimiertem manuellem Aufwand die Identifizierung von Proteinen auskomplexen Proteinproben heraus direkt von Western Blot-Membranen nach immunologischerDetektion und wird zukünftig derartige Analysen deutlich erleichtern.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler