Funktionelle Untersuchung zur Wirtsfaktorabhängigkeit pestiviraler Replikation
Lade...
Datum
Autor:innen
Betreuer/Gutachter
Weitere Beteiligte
Beteiligte Institutionen
Herausgeber
Zeitschriftentitel
ISSN der Zeitschrift
Bandtitel
Verlag
Lizenz
Zitierlink
Zusammenfassung
Das Genus Pestivirus bildet gemeinsam mit den Genera Flavi- und Hepacivirus die Familie der Flaviviridae. Vertreter des Genus Pestivirus sind das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe Typ 1 (BVDV-1), das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe Typ 2 (BVDV-2), das Virus der klassischen Schweinepest (CSFV) und das Border Disease Virus der Schafe (BDV). Pestiviren besitzen ein RNA-Genom von positiver Polarität, das etwa 12,3 Kilobasen (Kb) groß ist. Ein einziger offener Leserahmen (ORF), welcher im 5´- und 3´-Bereich von nichttranslatierten Regionen (NTRs) flankiert wird, kodiert für ein Polyprotein. Aufgrund der Fähigkeit in der Zellkultur nach Infektion einen zytopathischen Effekt auszulösen, werden zytopathogene (zp) und nichtzytopathogene (nzp) Biotypen unterschieden. Nur nzp BVDV Stämme können persistierende Infektionen hervorrufen. Die Viruspersistenz geht mit einer erworbenen Immuntoleranz gegen das infizierende Virus einher. Durch Rekombination oder Mutation im RNA-Genom des persistierenden Virus können zytopathogene (zp) Viren entstehen, welche die stets tödlich verlaufende Erkrankung Mucosal Disease (MD) im immuntoleranten Wirt auslösen. Eine Gemeinsamkeit der zp Stämme ist eine vermehrte Freisetzung des viralen Nichtstrukturproteins 3 (NS3) und eine damit verbundene verstärkte Synthese viraler RNA in infizierten Wirtszellen.Ein zelluläres Protein aus der Familie der J-Domänen-Chaperone hat wesentlichen Einfluss auf die Replikation von Pestiviren. Dieses Protein interagiert mit dem viralen Nichtstrukturprotein 2 (NS2) und wird daher als Jiv (kurz für: J-domain protein interacting with viral protein ) bezeichnet. Die Koexpression des Jiv-Proteins zusammen mit NS2-3 führt zur Spaltung von NS2-3 und damit zur Freisetzung von NS3. Einige zp BVDV Stämme tragen Jiv-kodierende Sequenzen in ihrem Genom, was eine unregulierte NS2-3-Prozessierung, eine hohe virale RNA-Replikationsrate und den zp Biotyp zur Folge hat.In der vorliegenden Arbeit konnte mithilfe eines auf Basis von Huh7 Zellen etablierten Assays erstmals gezeigt werden, dass das Jiv-Protein für die Replikation bestimmter nzp BVDV-1 Stämme essentiell ist. Darüberhinaus konnte mithilfe dieses Assays die Relevanz bestimmter Aminosäuren des Jiv-Proteins für dessen Unterstützung der viralen Replikation geklärt werden. Es wurden dabei zwei Regionen identifiziert, die für die Funktion des Jiv-Proteins im pestiviralen Lebenszyklus essentiell sind. Wird die Aminosäure Tryptophan an Position 39 zu Alanin (W39A) ausgetauscht, so unterbleibten die Aktivierung der viralen NS2 Protease und die NS2-3 Spaltung und damit die virale Replikation (NCP7-5A) in Huh7 Zellen. Ebenso führt eine Doppelmutation im NS2-Bindepeptid (Position 41 60 von Jiv90) an den Positionen 59 (Valin) und 60 (Tyrosin) zu einem Funktionsverlust von Jiv. Durch das Einfügen von Tetra-Alaninen hinter bestimmte Aminosäuren im Bereich des NS2-Bindepeptids wurde die Fähigkeit, die Replikation von nzp BVDV-1 NCP7-5A zu unterstützen ebenfalls stark beeinträchtigt. Dies spricht für eine besondere Bedeutung der Jiv-Region um das NS2-Bindepeptid. Jiv90 zeigte sich als das minimale Fragment, welches die nzp BVDV-1 NCP-5A Replikation noch unterstützen kann. Dies korreliert mit der Tatsache, dass Jiv90 die kleinste Jiv-Insertion im Genom von zp Pestiviren darstellt.Eine weitere Fragestellung dieser Arbeit beschäftigte sich mit der molekularen Ursache für den niedrigen Jiv-Protein Gehalt in Huh7 Zellen. Die mittels Real-Time RT-PCR quantifizierte Menge der Jiv-mRNA war im Vergleich zu BVDV empfänglichen Wirtszellen um etwa 50% reduziert. Das von der Jiv-mRNA aus Huh7 Zellen kodierte Protein konnte die BVDV-Replikation unterstützen. Somit legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass die molekulare Basis für den Jiv-Mangel in Huh7 Zellen auf posttranskriptioneller Ebene liegt.Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur essentiellen Rolle des Wirtsfaktors Jiv für die Replikation bestimmter nzp Pestiviren stellen einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der molekularen Grundlage für die Viruspersistenz bei Pestiviren dar.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2009