Verstärkung der Translation stromaufwärts gelegener Reportergene durch interne Ribosomen-Eintrittsstellen von Picornaviren

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2007

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10065

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In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, dass die internen Ribosomen-Eintrittsstellen (IRES) von Picornaviren die Translation nicht nur des stromabwärts gelegenen Gens fördern, sondern auch die Translation eines stromaufwärts der IRES gelegenen Gens verstärken können. Die Kenntnis dieses Effektes hat Auswirkungen auf die Interpretation der Ergebnisse von Replikations- und Translationsstudien mit dicistronischen Replikonsystem und das Design viraler Replikonsysteme. Die meisten zellulären mRNAs werden cap-abhängig translatiert. Dabei bindet der aus den eukaryotischen Initiationsfaktoren eIF4E, eIF4G und eIF4A bestehende Cap-Bindungs-Komplex eIF4F an das Cap-Nukleotid am 5' Ende der mRNA und bewirkt zusammen mit anderen Initiationsfaktoren die Bindung der kleinen ribosomalen Untereinheit an die mRNA. Bei einigen viralen und zellulären RNAs erfolgt dieser Vorgang dagegen Cap-unabhängig an einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES). Die IRES-Elemente der Picornaviren benötigen dafür alle eukaryotischen Initiationsfaktoren außer dem Cap-bindenden Protein eIF4E. Andere IRES-Elemente, wie das von Hepatitis C Virus (HCV), benötigen dafür außer eIF3 keine weiteren Initiationsfaktoren. Picornavirale IRES-Elemente werden vor allem in viralen Replikonsystemen, aber auch in dicistronischen (oder multicistronischen) Vektoren in der Gentherapie oder zur Analyse der Funktion der IRES-Elemente selbst verwendet. In solchen Vektoren wird oft die Expression des ersten, vor der IRES gelegenen Reportergens als interne Kontrolle verwendet, mit deren Hilfe die Expression des zur Messung der IRES-Aktivität verwendeten zweiten, stromabwärts der IRES gelegenen Reportergens standardisiert wird.Während Reportergene in dicistronischen Vektoren mit einer Picornavirus-IRES bis zu einer Salzkonzentration von 120 mM K+ optimal translatiert werden, werden Gene in einer monocistronischen mRNA meist nur bei Salzkonzentrationen bis etwa 90 mM K+ optimal translatiert. Werden diese Gene allerdings in einem dicistronischen Konstrukt vor einer Picornavirus-IRES eingefügt, werden auch sie bei höheren K+-Konzentrationen bis etwa 120 mM effizient translatiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Verstärkung der Translation unabhängig von der Natur des ersten Reportergens und von der Translation des zweiten, stromabwärts gelegenen Reportergens ist. Dieser Verstärkungseffekt erfolgt in cis und er tritt nicht bei Verwendung einer HCV-IRES auf. Bei Verwendung einer mutierten Picornavirus-IRES, die zwar noch die Bindungsstelle für eIF4G, aber keine IRES-Aktivität mehr aufweist, wird die Translation des stromaufwärts gelegenen Reporters noch effizient verstärkt. Der Effekt der Translations-Verstärkung wird durch kompetierendes Cap-Nukleotid gehemmt, was zeigt, dass eIF4F der entscheidend an diesem Vorgang beteiligte Faktor ist. Auch nachdem eIF4G mittels einer picornaviralen Protease gespalten wurde, konnte der erste Reporter noch effizient translatiert werden, das C-terminale Fragment von eIF4G ist also für die Verstärkung der Translation des ersten Reporters ausreichend. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass der eIF4F-Komplex, der an ein picornavirales IRES-Element in einer dicistronischen RNA über das eIF4G-Protein gebunden hat, in cis an das 5'-Ende der RNA weitergereicht werden kann, wo er entweder durch eIF4E an das Cap-Nukleotid oder wiederum über eIF4G an die RNA bindet und dann die Translation stimuliert.

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