Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von redoxaktiven Proteinen des Malariaparasiten Plasmodium falciparum
Lade...
Datum
Autor:innen
Betreuer/Gutachter
Weitere Beteiligte
Beteiligte Institutionen
Herausgeber
Zeitschriftentitel
ISSN der Zeitschrift
Bandtitel
Verlag
Lizenz
Zitierlink
Zusammenfassung
Aufgrund zunehmender Verbreitung der Erreger und wachsender Resistenzen werden neue Medikamente gegen Malaria dringend benötigt. Der Erreger der tropischen Malaria, Plasmodium falciparum, ist während seiner Vermehrung in menschlichen Erythrozyten einer enormen oxidativen Belastung ausgesetzt. Aufgrund dessen wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit das antioxidative System des Parasiten untersucht, dessen Bestandteile als Zielmoleküle für die rationale Medikamentenentwicklung von Bedeutung sind. Da Katalase und Glutathionperoxidase in Plasmodium fehlen, spielen die auf den NADPH-abhängigen Flavoenzymen Thioredoxinreduktase (TrxR) und Glutathionreduktase (GR) basierenden Systeme eine besondere Rolle. Hier konnte eine alternative Spleissvariante der TrxR-mRNA identifiziert werden, die analog zu den humanen Formen, Regulations- oder Targetingfunktion haben könnte. Einige putativ inhibitorische Verbindungen der TrxR wurden erfolgreich getestet, wobei die Spezifität für das Pf-Enzym herauszustellen ist. An Plasmodium-Kulturen wurden IC50-Werte im niederen mikromolaren Bereich für drei Substanzen bestätigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Proteine mit Trx-Aktivität (Trx2 und 3) und zwei weitere Trx-ähnliche Proteine (Tlp1 und 2) identifiziert, kloniert und exprimiert. Das Tlp1 ist wahrscheinlich regulatorischer Bestandteil des Dyneinmoleküls und somit für den intrazellulären Transport von Bedeutung. Tlp2 besitzt das active site-Motiv CPAC und ist evtl. membranständig oder im Mitochondrium lokalisiert. Die beiden neu identifizierten Trx-Proteine Trx2 und Trx3 sind Substrate der TrxR und werden aktuellen Vorhersagen zufolge in den Apicoplasten transferiert.Für die bislang als klassische Thioredoxinperoxidase bekannte PfTPx1 wurde im Rahmen dieser Arbeit Aktivität mit Glutaredoxin (Grx) gezeigt. Ferner wurde der Reaktionsmechanismus der TPx1 anhand von Cystein-Alanin-Austausch-Mutanten (C74A, C170A) untersucht, wobei sich insbesondere C170 als für die Trx-abhängige Aktivität bedeutsam erwies. Ebenfalls mit beiden Thiolproteinen aktiv ist das hier neu identifizierte Antioxidative Protein (AOP), ein Peroxiredoxin vom TypV. AOP reduziert u.a. Phosphatidylcholinhydroperoxid und stellt damit die erste Pf-Peroxidase zur Entgiftung von Lipidhydroperoxiden dar. Die Untersuchung der subzellulären Lokalisation zeigte das AOP1-66GFP-Fusionsprotein im ER von Toxoplasma gondii, obwohl in silico-Vorhersagen Apicoplast-Targeting indizierten. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, röntgentaugliche Kristalle von PfAOP zu züchten. Die Röntgenstrukturanalyse zeigte, dass AOP nativ als nicht-kovalentes Dimer vorliegt und mechanistisch ein 1-Cys-Prx darstellt. Anhand von Vergleichen mit anderen Prx-Strukturen kann ein charakteristischer Prx-fold beschrieben werden. Hochkonservierte AS-Reste, welche die active site bilden, finden sich auch in AOP. Verschiedene Interaktionstests bekannter Pf-Proteine ergaben, dass Trx1 und Grx Liponsäure bzw. Liponamid reduzieren. PfTrxR zeigt ebenfalls schwache LA-/LAM-Reduktase-Aktivität; diese Eigenschaft ist demnach nicht zwingend an ein Selenocystein gebunden. Wasserstoffperoxid wird von Trx1 umgesetzt, jedoch nicht von Grx. Trx1, Grx, TPx1 und auch Plasmoredoxin (Plrx), ein für Plasmodium spezifisches Redoxprotein, können Dehydroascorbat reduzieren. Plrx regeneriert darüber hinaus TPx1 und AOP.Schließlich wurde eine Hemmung von TrxR, Grx und GR durch Ferriprotoporphyrin IX (FP), einem Produkt des parasitären Hämoglobinabbaus, gezeigt. Da die Empfindlichkeit der PfGR jedoch deutlich geringer war als die der anderen untersuchten Redoxproteine und v. a. des glycolytischen Schlüsselenzyms Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase wird postuliert, dass bei beginnender FP-Toxizität zunächst die Glycolyse gedrosselt wird, um Glucose in den Hexosemonophosphatweg zu schleusen und somit NADPH zur Entgiftung von FP und reaktiven Sauerstoffspezies verfügbar zu machen. Insgesamt konnte im Rahmen dieser Arbeit das Verständnis des komplexen Redoxsystems von Malariaparasiten vergrößert werden. Es wurde ein Beitrag zur Strukturaufklärung möglicher Zielmoleküle der Medikamentenentwicklung geleistet, und verschiedene Inhibitorverbindungen wurden charakterisiert. Der Kenntnis des Wirkmodus gängiger Antimalaria-Substanzen wie Chloroquin, die die Steigerung der FP-Toxizität beinhaltet, wurden durch die hier erzielten Resultate neue Aspekte hinzugefügt.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Redox Report, 8 (2003), 246-250; The journal of biological chemistry, 278 (2003), 27354-27361; Journal of molecular biology, 346 (2005), 1021-1034