Detektion von geringfrequenten Varianten in B-Zell-Lymphomen zur genomischen Charakterisierung pädiatrischer Hodgkin-Lymphome mit primär erhöhter Chemotherapieresistenz
Pädiatrische Hodgkin-Lymphome (pHL) sind gut therapierbare maligne Tumore des lymphatischen Systems, deren 5-Jahre overall survival (OS) und event free survival (EFS) bei 97,4% und 89% liegt. 5% dieser Patienten zeigen eine primär reduzierte Chemotherapie-Sensitivität, erkennbar an einem qPET >
3 nach 2 Zyklen Induktions-OEPA-Chemotherapie und deren 2-Jahres EFS liegt bei 50%. Wegen des geringen Anteils an Hodgkin-Reed-Sternberg (HRS)-Zellen (ca. 1-5%) in den befallenen Lymphknoten ist die Untersuchung von HL, aufgrund der zuvor notwendigen Mikrodissektion der HRS-Zellen, außerordentlich schwierig, weshalb bislang nur wenige genomische Aberrationen bekannt sind und eine geringe Anzahl an Patienten untersucht wurde. Die Pathogenese aller pHL und die Unterschiede der chemotherapiesensitiven (qPET <
3) und primär chemotherapieresistenten Gruppe (qPET >
3) sind daher weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit sollte deshalb zunächst eine valide Methode zur Identifikation geringfrequenter Varianten mittels targeted Next Generation Sequencing (tNGS) ohne vorherige Mikrodissektion der HRS-Zellen etabliert werden.Hierfür kamen zwei tNGS-Panels zur Anwendung, die Abschnitte oder die vollständigen Bereiche von Genen abdeckten, die in HL und Non-HL häufig von single nucleotide variants (SNVs) und Indels betroffen sind. Es konnte durch die Untersuchung von insgesamt 22 pHL gezeigt werden, dass sich die hybrid-capture-basierte Methode unter Verwendung von circulating cell free DNA (ccfDNA), im Gegensatz zum Amplikon-basierten dual-strand-Verfahren mit genomischer DNA (gDNA), für die Detektion von niederfrequenten Varianten am besten eignet. Im Vergleich zwischen gDNA und ccfDNA konnte mit dem hybrid-capture-basierten Verfahren durch Untersuchungen an 11 pHL-Patienten gezeigt werden, dass ccfDNA für die niederfrequente Variantendetektion bei pHL geeigneter ist, als gDNA aus FFPE-Gewebe.Es wurde bei der Untersuchung von pHL-Patienten unter Verwendung von ccfDNA deutlich, dass der JAK/STAT-Signalweg mit Varianten in 64% der untersuchten Patienten, der am häufigsten betroffene Signalweg war, gefolgt vom PI3K/AKT-Signalweg mit Varianten in 41% der Patienten und dem NFkappaB-Signalweg mit Varianten in 36% der Patienten. In 22,7% der pHL-Patienten konnten Varianten detektiert werden, die mit Chromatin-modifizierenden Proteinen assoziiert sind. Zudem konnten in 64% der untersuchten Patienten Varianten identifiziert werden, die eine Immunevasion der HRS-Zelle begünstigen könnten, indem sie die Neo-Antigen (AG)-Präsentation verhindern. Insgesamt konnten sowohl bereits bekannte, sowie neue mutierte Gene identifiziert werden, die in HL derzeit unbekannt sind. Zudem konnte durch Untersuchungen an ccfDNAs durch Identifikation von klonalen VDJ/DJ-Rekombinationen in 32% der Patienten durch Mutationsanalysen gezeigt werden, dass auch die HRS-Zellen der pHLs von prä-apoptotischen germinal center (GC)-B-Zellen abstammen. Es wurde außerdem eine Translokation (IgH-Switch-Region gamma 2/AICDA) in einem pHL-Patienten identifiziert, die in HL bislang unbekannt war.Durch den Vergleich der Varianten-Allelfrequenz (VAF) der identifizierten Varianten, die in ccfDNAs, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Behandlung (vor, während und nach der Therapie) von 6 qPET >
3 und 10 qPET <
3 pHL-Patienten entnommen wurden, detektiert wurden, konnte zudem gezeigt werden, dass ccfDNA von pHL-Patienten durch ersichtliche Unterschiede zwischen den qPET <
3 und >
3-Patienten für das Therapiemonitoring geeignet ist und ein geeigneter Ansatz zu sein scheint, um das Ansprechen der Therapie bereits zu einem frühen Zeitpunkt überwachen zu können.Bei dem Vergleich der 9 chemotherapieresistenten- (qPET >
3) mit den 13 chemotherapiesensiblen Patienten (qPET <
3) fiel auf, dass der Anteil an Varianten je Patient bei den qPET >
3-Patienten erhöht war. Zudem konnte beobachtet werden, dass Varianten in Genen, die mit der AG-Präsentation assoziiert sind, bei den qPET >
3-Patienten mit 55%, im Gegensatz zu den qPET <
3-Patienten mit 23%, stark repräsentiert wurden.Außerdem konnte in dieser Arbeit durch eine Machbarkeitsstudie mit 11 pHL-Patienten zum ersten Mal gezeigt werden, dass sich ccfDNA von pHL für Ganz-Exom-Analysen eignet und die exomweite Detektion niederfrequenter Varianten ermöglicht.Zudem konnte bei der histologischen Untersuchung von 4 qPET >
3 und 5 qPET <
3-Patienten beobachtet werden, dass der Anteil an Pikrosiriusrot (PSR) positiven Zellen in den qPET >
3-Patienten signifikant erhöht war und dass tendenziell mehr kollagenummantelte HRS-Zellen in den qPET >
3-Patienten vorlagen, als in den qPET <
3-Patienten. Somit könnte die Feststellung bei Bauchspeicheldrüsen- und Brustkrebs-Patientinnen, dass eine erhöhte Expression von Kollagen zu einer Chemotherapieresistenz führt, auch bei den qPET >
3-Patienten der pHL einer der Gründe sein, die zu einer erniedrigten Chemotherapie-Sensitivität führt.
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