Das DNA mismatch-Reparatur (MMR) System erkennt und beseitigt neben Replikationsfehlern auch jene DNA-Schäden, die bevorzugt durch das very short patch repair (VSPR) oder base excision repair (BER) System repariert werden. Aus diesem Grund gewährleisten nicht im Detail verstandene Mechanismen ein komplexes und koordiniertes Zusammenspiel (crosstalk) dieser Reparatursysteme, welche bei der Reparatur von DNA Schäden in vivo sowohl konkurrieren als auch kooperieren können. Da das MMR System eine wichtige Rolle bei zahlreichen Prozessen im DNA-Metabolismus spielt, ist es von Interesse zu verstehen, wie dieses Zusammenspiel reguliert wird und so gewährleistet werden kann, dass die DNA effizient repariert wird. Obwohl seit 25 Jahren erforscht, ist nur wenig darüber bekannt, wie das MMR System einen DNA Schaden an geeignete Effektor Proteine übergibt und dabei mit Komponenten potentiell konkurrierender Reparatursysteme funktionell interagiert.In der vorliegenden Arbeit wurde daher in vitro untersucht, ob und wie VSPR bzw. BER auf bedeutende Aspekte im Mechanismus des MMR Systems Einfluss nehmen und so das Zusammenspiel regulieren. So wurde analysiert, welche Auswirkungen die Anwesenheit eines konkurrierenden Systems auf die Funktionen des transient gebildeten damage sensor and signalling complex (MutSL Komplex) haben. Zu diesem Zweck wurden spezifische zirkuläre DNA Substrate und Reparatur Assays entwickelt, die es erlaubten die initialen Schritte von MMR, VSPR und BER in vitro zu rekonstruieren. Dadurch war es möglich, wechselseitige Einflüsse zweier um die Beseitigung eines DNA-Schadens konkurrierender Systeme zu analysieren. Da die Erkennung eines Schadens durch MutS den ersten Schritt bei MMR darstellt, wurde ebenfalls untersucht, ob und wie die Prozessierung eines DNA Schadens durch VSPR bzw. BER die mismatch Erkennung durch MutS beeinflusst.In dieser Arbeit konnte erfolgreich gezeigt werden, auf welche Art und Weise MMR, VSPR und BER sich gegenseitig beeinflussen und so im crosstalk miteinander eine effiziente Reparatur gewährleisten. So stellte sich heraus, dass Vsr (VSPR), wie MutH und UvrD (MMR), zur Gruppe der Effektor Proteine gehört, die durch MutSL in einer mismatch und ATP abhängigen Reaktion aktiviert bzw. stimuliert werden (Kooperation). Dabei konkurrieren diese Effektor Proteine um die Rekrutierung und Aktivierung durch MutSL und somit um die Initiierung der Reparatur (Kompetition). Die erzielten Ergebnisse erklären die in vivo beobachtete funktionelle Beziehung zwischen MMR und VSPR und lassen vermuten, dass MutS, MutL und Vsr in E. coli ein Reparatur System (enhanced VSPR) bilden, welches eine effiziente Wiederherstellung des DNA Methylierungsmusters gewährleistet, auch wenn Vsr limitierend ist. Es wäre daher notwendig zu untersuchen, ob enhanced VSPR einen generellen Reparatur-Mechanismus darstellt, welcher auch in anderen Organismen existiert. Da ausgeschlossen werden kann, dass MutS und Vsr gleichzeitig an ein mismatch binden, unterstützen die hier erzielten Ergebnisse das Modell, bei dem MutS den zuvor erkannten Schaden in Form einer sliding clamp verlässt und anschließend ein transient mobiler MutSL Komplex je nach Bedarf anwesende Effektor Proteine rekrutiert und so die Reparatur einleitet. Dieses Modell wird auch dadurch unterstützt, dass MutH durch MutSL aktiviert wird, wenn ein DNA Schaden nur vier Basenpaare vom nächsten Strang Diskriminierungssignal entfernt ist.Das BER System verhindert ein unerwünschtes Prozessieren der DNA durch das MMR System, indem es die fehlerhafte Base (Uracil) aus der DNA entfernt. Obwohl die dabei entstehende abasic site (AP site) einen DNA Schaden darstellt, ist MutS entgegen den Erwartungen nicht in der Lage diesen Schaden zu erkennen. Somit können die Bildung des MutSL Komplexes und eine Aktivierung von Effektor Proteinen nicht erfolgen. Die Möglichkeit einen zuvor erkannten Schaden für MutS unkenntlich zu machen, kann zur funktionellen Analyse des multiple loading Models genutzt werden, welches beschreibt, wie das koordinierte Einleiten und Beenden von MMR gewährleistet wird.Um untersuchen zu können, ob MutS wie vermutet einen Schaden nach dessen Erkennen in Form einer sliding clamp wieder verlässt, wurden erste Versuche unternommen MutS während der mismatch-Bindung kovalent an die DNA zu koppeln und so den transienten MutS DNA Komplex für weitere funktionelle und strukturelle Studien einzufangen. Unter Verwendung der MutS Einzel-Cystein Varianten N468C und N497C sowie einem modifiziertem DNA Substrat war es möglich, transiente MutS DNA Komplexe mittels thiol spezifischem crosslinking einzufangen und so den mismatch Sensor an die Leine zu nehmen. Diese Komplexe konnten erfolgreich aufgereinigt werden und bilden somit einen optimalen Startpunkt für weitere funktionelle (z.B. ATPase Aktivität, DNA Biegung, Initiierung der DNA Reparatur) und strukturelle Studien (z.B. Kristallisation von MutS als sliding clamp) zur mismatch-Erkennung durch MutS.
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