Caveolae sind einerseits in den Prozess der Transzytose und in verschiedene Signaltransduktionswege involviert, können aber auch als Eintrittspforte für Krankheitserreger dienen. Caveolin (Cav)-1 und -2 sowie die als muskelspezifisch geltende Isoform Cav-3 sind die Strukturproteine von Caveolae, wobei biochemische Untersuchungen eine direkte Interaktion von Cav-1 und Cav-2 nahe legen. Obwohl im Atemwegsepithel viele Signalproteine vorkommen, wie IP3-Rezeptoren und eNOS, die in ihrer Funktion durch Caveoline reguliert werden können, ist das Vorkommen von Cav-Isoformen und von Caveolae im Atemwegsepithel bisher nicht bekannt.
Daher haben wir die Expression der mRNA und der Proteine aller drei Cav-Isoformen mittels RT-PCR und Western Blot untersucht und deren Lokalisation im Tracheal- und Bronchialepithel mittels Immunhistochemie bestimmt. Das Vorkommen von Caveolae wurde auch ultrastrukturell untersucht. Um eine enge räumliche Assoziation zwischen Cav-1alpha und Cav-2 in einzenen Zellen in Gewebeschnitten nachzuweisen, wurde eine neue Technik etabliert. Diese basiert auf indirekter Doppelimmunfluoreszenz mit nachfolgender Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Analyse im CLSM. Diese Methode wurde zunächst am Endothel etabliert und nachfolgend zur Detektion der Assoziation von Cav-1 und -2 im Epithel eingesetzt. Der statistische Vergleich von FRETeff und deltaIF zeigte deutlich, dass deltaIF viel sensitiver und spezifischer zwischen Versuchs- und Kontrollbedingungen diskriminiert. Im Prinzip sind weder die Wahl des sekundären Reagenzes noch der Applikationsmodus entscheidend für das FRET-Ergebnis. Entscheidend sind die Spezifität der Antikörper und eine kontrollierte Stabilität des Messsystems. Diese Technik bietet die Möglichkeit, Einblicke in Protein-Protein-Interaktionen in Gewebeschnitten von normalem sowie auch pathologisch verändertem Gewebe zu gewinnen, einschließlich der Untersuchung von humanen Proben, die durch chirurgische Eingriffe erlangt und über Jahre archiviert wurden.
Protein und mRNA für alle drei Cav-Isoformen wurden im abgeschabtem Trachealepithel und in der Lunge detektiert. Immunhistochemisch wurden Cav-1 und Cav-2 in den Basalzellen und alle drei Cav-Isoformen in den zilientragenden Zellen der großen Atemwege nachgewiesen. Cav-1alpha- und Cav-2-Immunreaktivität waren in den zilientragenden Zellen an der basolateralen Plasmamembran kolokalisiert, wo auch ultrastrukturell Caveolae gefunden wurden. Cav-3-Immunreaktivität fand sich in diesen Zellen dagegen apikal, kolokalisiert mit eNOS und CHT1. Diese Proteine sind in der Regulation der Zilienschlagfrequenz beteiligt. Hier waren ultrastrukturell keine Caveolae nachweisbar, hingegen fand sich unter den Basalkörperchen der Zilien ein tubulovesikuläres Netzwerk, das sich in engem Kontakt mit den Mitochondrien befand. In Cav-1-defizienten Mäusen fanden sich im Epithel weder Cav-1alpha-Immunreaktivität noch Caveolae, wobei in Wildtyp-Mäusen Cav-1alpha und Caveolae in den Basalzellen vorhanden waren. Im Gegensatz zur Ratte besaßen die zilientragenden Zellen der Maus weder Cav-1alpha-Immunreaktivität noch Caveolae. Mittels FRET-CLSM-Analyse konnten wir auf Einzelzellebene im Atemwegsepithel der Ratte eine Assoziation von Cav-1alpha und Cav-2 nachweisen.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass Caveolae und alle Cav-Isoformen in Bronchial- und Trachealepithel vorhanden sind, wobei eine direkte Interaktion von Cav-1alpha und Cav-2 angenommen werden kann. Die Ergebnisse weisen auf Funktionen aller drei Cav-Isoformen in Signaltransduktionswegen des Atemwegsepithels hin. Im apikalen Bereich der zilientragenden Zellen befindet sich ein tubulovesikuläres Kompartiment, das durch Cav-3 organisiert und in der Regulation der Zilienschlagfrequenz involviert sein könnte. Cav-1 und Cav-2 führen zur Bildung von Caveolae in Basalzellen und zilientragenden Zellen.
Eine weitere Aufklärung der Funktion von Cav-1, -2 und -3 im Atemwegsepithel in situ ist besonders im Hinblick auf die in dieser Arbeit gefundene neue Lokalisation der Caveoline wichtig. Die Grundlagen hierfür konnten durch die hier vorliegende Arbeit geschaffen werden.
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