Entwicklung von Methoden zur harmonisierten Empfindlichkeitstestung von Avibacterium gallinarum, Avibacterium paragallinarum, Bordetella avium, Mycoplasma („Mycoplasmopsis“) bovis und Mycoplasma („Mycoplasmoides“) gallisepticum im Mikrodilutionsverfahren

Abstract

Die Ausbreitung antibiotikaresistenter Krankheitserreger in der Human- und Veterinärmedizin gibt weltweit Anlass zur Sorge. Die Anwendung standardisierter antimikrobieller Empfindlichkeitstests (AST) ist ein wichtiges Hilfsmittel, um eine gezielte Therapie von Infektionen durchführen zu können. Auch wenn für viele bakterielle Erreger bereits anerkannte AST-Standardmethoden zur Verfügung stehen, fehlen diese für einige bakterielle Erreger. Dies galt auch für die tierpathogenen Bakterienspezies Av. gallinarum, Av. paragallinarum, B. avium, M. bovis und M. gallisepticum. Ziel dieser Arbeit war es daher, für diese fünf Spezies geeignete Methoden zur standardisierten AST im Bouillon-Mikrodilutionsverfahren zu entwickeln, die einen routinemäßigen Einsatz in veterinärdiagnostischen Laboratorien ermöglichen und quantitative Empfindlichkeitsdaten in Form von minimalen Hemmkonzentrations (MHK)-Werten) bestimmen. Zu Beginn der Arbeiten wurden für alle fünf Bakterienspezies-Isolate für die Durchführung der Untersuchungen akquiriert. Mit Ausnahme von M. gallisepticum wurden anhand von Makrorestriktionsanalysen jeweils fünf epidemiologisch nicht verwandte Testisolate für nachfolgende Arbeitsschritte identifiziert. Um ein geeignetes Medium für die Bouillon-Mikrodilutionstests zu finden, wurden anschließend umfangreiche Wachstumsexperimente mit verschiedenen Medien durchgeführt. Alle getesteten Av. gallinarum- und B. avium-Isolate zeigten ein gutes Wachstum in der Kationen-adjustierten Mueller-Hinton-Bouillon (CAMHB), die vom Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) für die AST schnell wachsender Mikroorganismen empfohlen wird. Av. paragallinarum zeigte nur in CAMHB plus 1 % Hühnerserum + 0,0025 % NADH (CAMHB+CS+NADH) ausreichendes Wachstum, ein Medium, welches für die standardisierte AST des eng verwandten Erregers G. parasuis vorgeschlagen wurde. Da Mykoplasmen in der Regel keine sichtbare Trübung in der bebrüteten Bakterienkultur zeigen, wurden für die Wachstumsexperimente mit M. bovis und M. gallisepticum komplexe Spezialmedien mit einem pH-Indikator verwendet. Beide Mykoplasmen-Spezies zeigten ausreichendes Wachstum ausschließlich in der SP4-Bouillon, die vom CLSI für die AST humanpathogener Mykoplasmen akzeptiert ist. Anschließend wurden wiederholte Empfindlichkeitstests zur Ermittlung der exakten (Anforderung von fünf identischen MHK-Werten) und essentiellen (MHK-Modus, der eine Abweichung von ± 1 Verdünnungsstufe akzeptiert) MHK-Übereinstimmungen durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der MHK-Werte zu bewerten. Je nach getesteter Spezies wurde dazu ein Panel von 16 oder 24 antimikrobiellen Wirkstoffen einbezogen. Bei Verwendung der nicht supplementierten CAMHB und einer Inkubation von 20 h bei 35 ± 2 °C in aerober Atmosphäre wurde eine gute Homogenität der MHK-Werte von B. avium nachgewiesen. Obwohl das gleiche Medium gutes Wachstum von Av. gallinarum zeigte, wurde eine geringe Homogenität der MHK-Werte von Av. gallinarum in dem Medium festgestellt. Aus diesem Grund wurde die Eignung der CAMHB+CS+NADH analysiert, die ebenfalls gutes Wachstum von Av. gallinarum ermöglichte. In diesem Medium wurden nach einer Inkubation für 20 bis 24 h bei 35 ± 2 °C in aerober Atmosphäre homogene MHK-Werte bestimmt. Unter Verwendung des gleichen Mediums wurden auch für die eng verwandte Spezies Av. paragallinarum homogene MHK-Werte ermittelt, wobei dafür eine längere Inkubationszeit von 48 h erforderlich ist. Für die besonders anspruchsvollen Erreger M. bovis und M. gallisepticum wurden nach einer Inkubation von 72 ± 2 h bei 37 °C in aerober Atmosphäre homogene MHK-Werte in der SP4-Bouillon erzielt. Insgesamt führten diese Testbedingungen bei allen fünf Erregern zu hohen exakten und wesentlichen MHK-Übereinstimmungen, die die Anforderungen des CLSI erfüllen. Es zeigte sich, dass sich herkömmliche Qualitätskontrollstämme (QC-Stämme) für die Qualitätskontrolle der AST von Av. gallinarum, Av. paragallinarum und B. avium eignen. Ein Eignungstest dieser QC-Stämme für die Qualitätskontrolle der für M. bovis und M. gallisepticum entwickelten AST-Methode ergab, dass viele MHK-Werte außerhalb der vom CLSI akzeptierten MHK-Bereiche lagen. Aus diesem Grund wurde im nächsten Schritt die Eignung eines Typstammes für die Qualitätskontrolle gemäß der CLSI-Richtlinie M23 geprüft. Zwanzig Empfindlichkeitstests mit dem M. bovis-Typstamm DSM 22781T ergaben homogene MHK-Werte, die die CLSI-Anforderungen an einen neuen QC-Stamm erfüllen. Ein Vergleich von MHK-Werten unter Verwendung von Medienkomponenten verschiedener Hersteller zeigte eine allgemein gute Reproduzierbarkeit der MHK-Werte für alle in die Studie einbezogenen Erreger. Eine gute Eignung der für B. avium entwickelten Methode zeigte sich zudem durch die Ergebnisse einer Laborvergleichsstudie, die in Zusammenarbeit mit dem BVL durchgeführt wurde. Bei allen Erregern wurden Isolate identifiziert, die im Vergleich zu den anderen Isolaten erhöhte MHK-Werte für verschiedene Wirkstoffklassen (z.B. Aminoglykoside, Fluorchinolone, Makrolide, Tetrazykline) aufwiesen. Um die Übereinstimmung zwischen dem MHK-Wert und dem Resistenzgenotyp zu überprüfen, wurden mit Av. gallinarum-, Av. paragallinarum- und B. avium-Isolaten mit erhöhten MHK-Werten PCR-Analysen durchgeführt, um antimikrobielle Resistenzgene nachzuweisen, und es wurde eine gute Übereinstimmung festgestellt. Die Ergebnisse dieser PCR-Analysen sowie die der WGS-Analysen von Av. paragallinarum zeigten zudem, dass einige dieser Isolate mehrere Gene trugen, die eine Resistenz gegen verschiedene Wirkstoffklassen vermitteln. In dieser Arbeit gelang auch erstmals der Nachweis der folgenden Resistenzgene bei Av. gallinarum, Av. paragallinarum und/oder B. avium: aadA11, aph(3'')-Ib, blaTEM-1, catA2, dfrA14, dfrB1/2/3, floR, mcr-like, sul2, tet(B) und tet(H). Da Resistenzen bei Mykoplasmen in der Regel auf chromosomale Mutationen zurückzuführen sind, wurden mit M. bovis und M. gallisepticum keine Resistenzgenanalysen durchgeführt. Die bei M. bovis und M. gallisepticum festgestellten bimodalen oder breiten MHK-Verteilungen für Aminoglykoside, Fluorchinolone oder Makrolide sind jedoch ein Hinweis auf das Vorliegen resistenter Isolate. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Promotionsarbeit entwickelten Bouillon-Mikrodiutionsmethoden für eine standardisierte AST der fünf tierpathogenen Erreger Av. gallinarum, Av. paragallinarum, B. avium, M. bovis und M. gallisepticum geeignet sind. In future, these methods may help to select the most suitable antibiotic in case treatment is necessary and to counteract antimicrobial resistance selection in these pathogens.