Isolierung und Feintypisierung von Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE) aus Geflügel- und Schweinefleisch
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Zusammenfassung
Enterokokken gehören zu den häufigsten nosokomialen Infektionserregern Harnwegs- und Wundinfektionen, Sepsis, Endocarditis). Die zunehmende Resistenzentwicklung bei Enterococcus (E.)-Stämmen vor allem gegen die Glycopeptidantibiotika Vancomycin (gebildet von Amycolatopsis orientalis) und Teicoplanin (gebildet von Actinoplanes teichomyceticus) ist Grundlage für intensive Untersuchungen. Die Anwendung des Fütterungsantibiotikums Avoparcin wurde aufgrund des Verdachtes, dass dessen Verwendung in der Tiermast zur Entwicklung von Kreuzresistenzen gegen diese Antibiotika bei Enterokokken führt, in Deutschland im Januar 1996 und in der EU im April 1997 untersagt. In eigenen Untersuchungen sollten Enterokokken aus 115 Geflügel- und 50 Schweinefleischproben auf dem CATC-Agar (Citrat Azid Tween Carbonat Agar) isoliert und zunächst einer orientierenden Überprüfung auf Vancomycin-Resistenz auf dem Co-lumbia CNA Agar (Colistin Nalidixin Azid Agar, supplementiert mit 5% Schafblut und 5 mg Vancomycin/l) unterzogen werden. Klinische Isolate und Referenzstämme wurden in den Untersuchungen einbezogen. Von 1691 E.-Isolaten aus den Geflügel- und Schweinefleischproben konnten mithilfe des Vancomycin-supplementierten Columbia CNA Agar 420 Isolate als Vancomycin-resistent identifiziert werden. Alle 420 als resistent identifizierten E. Isolate wurden mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit spezifischen Primern zum Nachweis der Vancomycin-Resistenz-vermittelnden van-Gene untersucht ('high level': vanA; 'moderate-high level': vanB; 'low level': vanC1, vanC2 und vanC3). Die Spezifität der van-Gen-typischen Amplifikate wurde mithilfe der Restriktionsanalyse unter Verwendung der CfoI- (vanA) und DdeI- (vanB) Endonucleasen überprüft. Für die intraspezifische Differenzierung vanA-positiver VRE-Isolate wurde für die Randomly Amplified Poly-morphic DNA-Methode (RAPD) der Primer 'kay3'- und für die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) die Restriktionsendonuclease SmaI verwendet. Das vanA-Gen konnte bei 203 Isolaten (127 E. faecium, 31 E. faecalis, 34 E. durans, 10 E. hirae und ein E. gallinarum) aus 50 (43,5%) Geflügelfleischproben, in keinem Fall bei Isolaten aus Schweinefleischproben nachgewiesen werden. Das vanB-Gen konnte in keinem Fall ermittelt werden. Das vanC1-Gen konnte bei 39 E. gallinarum-Isolaten aus 24 (20,7%) Geflügel-fleischproben und einer Schweinefleischprobe (2,0%) nachgewiesen werden. Dabei war ein E. gallinarum-Isolat vanA- und vanC1-Gen-positiv. Das vanC2-Gen konnte bei einem E. flavescens- und 22 E. casseliflavus-Isolaten aus 12 (10,4%) Geflügel-fleischproben und vier (8,0%) Schweinefleischproben nachgewiesen werden. Das vanC3-Gen konnte bei einem E. flavescens- und acht E. casseliflavus-Isolaten aus zwei (1,7%) Geflügelfleischproben und drei (6,0%) Schweinefleischproben nach-gewiesen werden. Dabei war ein E. flavescens- und acht E. casseliflavus-Isolate vanC2- und vanC3-Gen-positiv. VanC-positive VRE konnten in 33 Geflügel- (28,7%) und fünf Schweinefleischproben (10,0%) nachgewiesen werden. Davon konnten aus 14 Geflügelfleischproben VRE isoliert werden, die das vanA- und das vanC-Gen besitzen. Alle Enterokokken, bei denen das vanA-Gen nachgewiesen werden konnte, wurden mit der RAPD- und der PFGE-Methode einer Feintypisierung unterzogen. Die RAPD stellte sich in Verbindung mit der DNA-Isolierung mit dem QIAamp Tissue Kit in der vorliegenden Arbeit als ein zuverlässiges und reproduzierbares Verfahren für die Feintypisierung inter speciem heraus. Es konnten die biochemisch identifizierten Spezies E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae, E. casseliflavus und E. gallinarum mithilfe des universellen Primers 'kay3' jeweils einem spezifischen Bandenmuster zugeordnet und demnach eindeutig identifiziert werden. Die Untersuchungen mit der PFGE zeigen, dass aus dem humanmedizinisch-klinischen Bereich stammende Isolate von denen aus Lebensmitteln deutlich abzu-grenzen sind. Zudem sind die Enterokokken durch eine beachtliche genotypische Heterogenität gekennzeichnet. Die Ergebnisse der PFGE-Untersuchungen und die Ähnlichkeiten der Feintypisierungs-Bandenmuster einiger Enterococcus-Isolate konnten anhand von Dendrogrammen dokumentiert werden. Es zeigt sich, dass die größte Übereinstimmung der SmaI-Restriktionsmuster zwischen den Isolaten aus Geflügelfleisch und den klinischen Isolaten bei 78% liegt. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass Lebensmittel tierischen Ursprungs durch den Einsatz von Fütterungsantibiotika in der Tiermast als weitere Quelle für die Resistenz-Entwicklung angesehen werden müssen. Auch nach dem Avoparcin-Verbot sind weiterhin VRE-Stämme nachzuweisen.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Wettenberg : VVB Laufersweiler 2003