Charakterisierung von Aspartylglucosaminidase-Varianten und Erprobung von personalisierten Therapien in vitro

Abstract

Aspartylglucosaminidase (AGA) ist eine lysosomale Hydrolase, welche für die letzten Schritte des Abbaus von N-glykosylierten Proteinen verantwortlich ist. Sie katalysiert die Spaltung des Asparagins von N-Acetylglukosamin-Bindungen nach dem Abbau der Polypeptidkette. AGA wird als Vorläuferpeptid synthetisiert und im endoplasmatischen Retikulum in Untereinheiten gespalten. Die Aspartylglucosaminurie (AGU) ist eine Er-krankung, die durch die fehlende Aktivität des AGA-Enzyms gekennzeichnet ist. Die Erkrankung tritt gehäuft in der finnischen Bevölkerung auf. Die Erkrankten werden phänotypisch gesund geboren, doch bereits im Kindesalter kommt es zur Verzögerung der Entwicklung. Bislang sind mehr als 30 verschiedene krankheitsverursachende AGA-Genvarianten bekannt, wobei die meisten Missense-Mutationen sind. Die Ziele meiner Arbeit waren die Charakterisierung von zwei pathogenen AGA-Varianten. Die AGA-Variante Cys179Arg wurde bei einem italienischen Geschwisterpaar diagnostiziert, während die AGA-Variante Gly302Arg bei Patienten türkischer Herkunft nachgewiesen wurde. Hierzu habe ich die beiden Varianten in Expressionsplasmide kloniert und die Expression, Prozessierung und Aktivität der Enzymvarianten untersucht. Hierbei wurde bewiesen, dass bei der Variante C179R die Prozessierung zu einem geringen Anteil stattfindet. Die entstehende Enzymvariante zeigt eine geringe, aber messbare Restaktivität. Bei der Variante G302R findet keine Prozessierung statt, und es zeigt sich keine Restaktivität. Des Weiteren habe ich die Auswirkung einer Kotransfektion von AGA-Wildtyp mit jeweils einer der beiden AGA-Varianten untersucht. Hierbei kam es bei keiner der Varianten zu einer Stabilisierung der Vorläuferpeptide oder zur Verbesserung der Prozessierung. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen von zwei pharmakologischen Chaperonen auf die Prozessierung und Aktivität der beiden AGA-Enzymvarianten zu untersuchen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Glycin einen positiven Einfluss auf die Prozessierung und Aktivität der C179R-Variante hat. Es konnte jedoch kein nennenswerter Einfluss von Betain gezeigt werden. Ebenso zeigte sich bei einer Behandlung mit Chaperonen kein positiver Einfluss auf die Prozessierung und Aktivität der G302R-Variante. Somit wäre denkbar, dass Glycin als mögliches Therapeutikum für die AGU-Variante C179R in Frage kommt, der Wirkungsgrad der verschiedenen Chaperone jedoch stark abhängig von den einzelnen Varianten ist.