Molekulargenetische Effekte nach Inhibitorbehandlungen sowie Charakterisierung gonadenspezifisch exprimierter Gene von Schistosoma mansoni
Lade...
Datum
Autor:innen
Betreuer/Gutachter
Weitere Beteiligte
Beteiligte Institutionen
Herausgeber
Zeitschriftentitel
ISSN der Zeitschrift
Bandtitel
Verlag
Lizenz
Zitierlink
Zusammenfassung
Der human- und tierpathogene Trematode Schistosoma mansoni besitzt eine nahezu einzigartige Reproduktionsbiologie, bei der es erst durch einen permanenten Paarungskontakt mit dem Männchen zur sexuellen Reifung des Weibchens kommt, eine Voraussetzung für die Eiproduktion und die Aufrechterhaltung des Lebenszyklus. Grundlagen dieses Prozesses sind die Steigerung mitotischer Aktivität sowie die Initialisierung verschiedener Signaltransduktionskaskaden in den weiblichen Reproduktionsorganen, die Differenzierungsprozesse steuern. Einige hoch konservierte Moleküle dieser Signalwege konnten bereits identifiziert und charakterisiert werden, darunter der Typ I-Rezeptor der TGFbeta-Familie (SmTbetaRI) und zelluläre Src-Tyrosinkinasen wie SmTK3. Erste funktionelle Studien in vitro mit spezifischen Inhibitoren für Typ I TGFbeta-Rezeptoren (TRIKI) und Src-Kinasen (Herb A) zeigten einen Einfluss dieser Moleküle auf die mitotische Aktivität der Weibchen und die Oviposition. Ferner führte die Kombination beider Inhibitoren zu additiven Effekten dieser physiologischen Veränderungen, weshalb eine Kooperation beider Signalwege postuliert wurde. Eine Inhibierung der SmTK3 durch Herb A wurde bereits beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit konnte anhand eines Kinase-Assays gezeigt werden, dass TRIKI SmTbetaRI im heterologen Xenopus-Oocyten-System inhibiert. Ferner wurden vergleichende Transkriptomstudien zur Identifizierung von differentiell regulierten Genen nach in vitro Behandlung adulter Schistosomenweibchen mit TRIKI bzw. Herb A (einzeln oder in Kombination) mit Hilfe von Microarrays durchgeführt. Dies führte zur Identifizierung einer Vielzahl an Genen, die unter gemeinsamer transkriptioneller Kontrolle der SmTbetaRI- sowie Src-Kinasen-vermittelten Signalwege stehen. Diese Gene kodieren u.a. Signalmoleküle, Ca2+-assoziierte Proteine, Hsp- und Oberflächenproteine sowie darmassoziierte Moleküle. Die Transkriptionsänderungen wurden exemplarisch durch qPCR-Analysen bestätigt, wodurch ein weiterer und erster molekularer Hinweis für die Kooperation beider Signalwege erbracht wurde. Darüber hinaus deuteten die Daten auf einen stärkeren Einfluss des Src-Kinasensignalwegs auf die Regulation der Transkription.Aufgrund der beschriebenen reduzierten Oviposition durch diese Inhibitoren in vitro lag ein Fokus weiterer Analysen auf der Untersuchung differentiell regulierter Gene, deren kodierte Proteine Funktionen bei der Eischalsynthese besitzen. Bei repräsentativ ausgewählten Genen wie den Eischalvorläufergenen p14 und p48 sowie dem SmTYR1-Gen, das für das schistosomale Eischalprotein-Vernetzungsenzym Tyrosinase 1 kodiert, konnte die modulierende Regulation der Transkription durch die kooperativ agierenden SmTbetaRI- und Src-Kinase-Signalwege bestätigt werden. Dabei korrelierte die reduzierte Transkription mit der ebenfalls reduzierten Eiproduktion nach Herb A-, bzw. Kombinationsbehandlung. Daneben offenbarten mikroskopische Untersuchungen der Morphologie inhibitor-behandelter adulter Würmer zum ersten Mal auch eine stark veränderte Gastrodermis nach Langzeitbehandlung (5-6 Tage) mit Herb A oder TRIKI/HerbA. Dieser Befund erklärt das Sterben der Würmer nach dieser Expositionsdauer.Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden weiterführende funktionelle Studien für identifizierte Interaktionspartner der gonadenspezifisch exprimierten Kinasen SmTK3 und SmTK6 durchgeführt. Dabei konnte SmEps8 als häufigster und stärkster upstream-Interaktionspartner der SmTK3 charakterisiert werden. Bei SmEps8 handelt es sich um ein potentielles EGFR-Substrat, dessen Interaktion mit EGFR-Molekülen aus S. mansoni (SER) untersucht wurde. Mit Hilfe von Y2H-Experimenten konnte eine schwache Bindung zwischen SmEps8 und den intrazellulären Bereichen von SER und SER2 detektiert werden. Mit Hilfe von in situ-Hybridisierungen wurde eine Kolokalisation der Transkripte von SmTK3, SmEps8 und SER in Ovar und Vitellarium festgestellt, womit diese Ergebnisse auf eine putative SER-SmEps8-SmTK3-Signalkaskade in den Reproduktionsorganen des Weibchens hindeuten. In einer vorhergehenden Studie wurde bereits SmDLG als ein upstream-Interaktionspartner der Src-/Abl-Hybridkinase SmTK6 identifiziert. In Drosophila melanogaster bildet SmDLG einen Komplex mit den Proteinen Scrib und LGL, der u.a. Zellpolarität kontrolliert. Durch Datenbankanalysen konnten ähnliche Proteine dieser potentiellen Bindungspartner in S. mansoni identifiziert und im Weiteren kloniert werden (SmScrib und SmLGL). Anschließende Y2H-Versuche führten zu ersten Hinweisen für direkte Interaktionen dieser drei Moleküle. Schließlich wurden die Transkripte dieser Gene über in situ-Hybridisierungen hauptsächlich im Ovar detektiert. Diese Resultate deuten die Möglichkeit molekularer Interaktionen von SmTK6, SmDLG, SmScrib, und SmLGL an und geben einen ersten Hinweis auf eine Signalkaskade, die Zellpolarität in den Oocyten über eine Src-/Abl-Hybridkinase steuern könnte.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Die erhaltenen Rohdaten der Microarray-Analyse sind in der GEO Datenbank unter der Studiennummer GSE39732 erhältlich. Der digitale Anhang mit den bearbeiteten Tabellen der Microarray-Analyse liegt auf CD der gedruckten Ausgabe der Dissertation bei.