Herstellung von hypoallergenen Möhren (Daucus carota) und Analyse ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber mikrobiellen Pathogenen

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Herstellung von hypoallergenen Möhren(Daucus carota) mittels der RNA Interferenz-Technologie (RNAi) und mit der Analyse derAnfälligkeit dieser Möhren gegenüber mikrobiellen Phytopathogenen. Der Fokus der Arbeitlag auf dem Möhrenprotein Dau c 1. Es kommt in zwei Isoformen Dau c 1.01 und Dau c 1.02vor. Das Dau c 1 ist das Hauptallergen der Möhre und gehört gleichzeitig der Familie derPathogenese-assoziierten Proteine 10 (PR10) an. Etwa 98% der Möhrenallergiker reagierenauf dieses Protein allergisch. Die Hauptursache für diese Möhrenallergie ist eineKreuzallergie mit Birkenpollen. Die Funktion des Dau c 1-Proteins für dasMöhrenimmunsystem und die Möhrenentwicklung ist weitgehend unbekannt. In anderenPflanzen konnten diverse Funktionen für die PR10-Proteine festgestellt werden, wie z.B.Ribonuklease- und antigungale Aktivität.Um die Funktion der Dau c 1-Isoformen untersuchen zu können, wurden beide Isoformen,Dau c 1.01 und Dau c 1.02, unabhängig voneinander mittels RNAi in der Möhre (Daucuscarota spp. sativus) des Kultivars Rodelika supprimiert. Es konnten zum ersten Mal deutlichsupprimierte hypoallergene Möhren regeneriert werden. Eine im Vergleich zuWildtypmöhrenblättern ~10-fache Reduktion der jeweiligen Isoform lag in den Blättern derRNAi-Pflanzen vor. Die deutliche Reduktion der jeweils unterdrückten Dau c 1-Isoformwurde auch proteinbiochemisch mit spezifischen Antikörpern in den Dau c 1.01- und Dau c1.02-supprimierten Möhrenwurzeln festgestellt. Die meisten Pflanzen entwickelten sich wieWildtyppflanzen und zeigten keine Phänotypänderungen. Bei zwei unabhängigen Linienkonnte eine Morphologieänderung der Blätter beobachtet werden, die vermutlichInsertionsartefakte darstellten.Es konnte in Resistenzanalysen nachgewiesen werden, dass die hypoallergenen Möhren nichtanfälliger gegenüber den pilzlichen Phytopathogenen Alternaria dauci, Alternaria radicinaund Botrytis cinerea sind. Diese drei Pilze verursachen den größten agronomischen Schadenan der Möhrenernte. Es findet auch keine Hochregulation der Dau c 1-Isoformen nachAlternaria radicina-Befall statt. Dies kann damit zusammenhängen, dass diese nekrotrophenPilze nicht die Salizylsäure-abhängige (SA) Abwehr der Pflanze aktivieren, die die PR10-Transkription nachweislich induziert. Die unbeeinträchtigte Besiedlung der RNAi-Pflanzenlegt nahe, dass die Dau c 1-Isoformen nicht an der Abwehr der getesteten Pathogene beteiligtsind bzw. dass verwandte PR-Proteine in den Dau c 1.01-supprimierten bzw. in den Dau c1.02-supprimierten Möhren kompensatorisch wirken. Für Letzteres spricht, dass in denResistenzanalysen Hinweise auf eine Kompensation durch die Proteine DcPRPlike1 und PR3vorlagen. Durch eine SA-Behandlung der Blätter konnte nachgewiesen werden, dass die Dauc 1 Isoformen in den hypoallergenen Möhren durch SA induzierbar waren. Hierbei zeigte sicheine Hochregulation der jeweils nicht supprimierten Isoform.An Patienten durchgeführte Skin-prick-Tests mit RNAi-Möhren zeigten, dass es zueiner reduzierten allergischen Hautreaktion bei Personen kam, die monosensibilisiertgegenüber einer der beiden Dau c 1-Isoformen waren. In den IgE-Bindungsreaktionen mitPatientenseren konnte eine deutlich reduzierte IgE-Reaktion mit den Dau c 1.01-supprimierten Möhrenproteinextrakten gegen das Dau c 1-Protein festgestellt werden. DesWeiteren konnten in den IgE-Bindungsreaktionen gegen Dau c 1-Isoformen weitere, nochnicht charakterisierte, hochmolekulare Möhrenproteine festgestellt werden. The main allergenic protein Dau c 1 of carrots (Daucus carota) causes an allergenicreaction by 98% of people who suffer from carrot allergy. The main reason for this allergy isa cross-reaction between Dau c 1 and Bet v 1, the main allergen of Birch pollen. Dau c 1 isnot alone a main allergen, it also belongs to the pathogenesis-related protein family 10(PR10). Two isoforms Dau c 1.01 and Dau c 1.02 of Dau c 1 exist. The function of Dau c 1 incarrot development and in carrot defence strategies is unknown. In other plants, manydifferent functions of PR10 were detected, e.g. ribonuclease activity and antifungal activity.In the work at hand, hypoallergenic carrots were generated for the first time. This wasachieved by the use of the RNA interference technology.The functions of the two Dau c 1 isoforms in carrots were analysed in these hypoallergeniccarrots in relation to their function in pathogen defence. The isoforms were silencedseparately in carrots of the cultivar Rodelika. For the first time clearly silenced hypoallergeniccarrots were generated. In the leaves a ~10-fold reduction of each isoform was determined.An evident reduction of each suppressed isoform was also determined protein-biochemicallyby the use of the respective specific Dau c 1.01 and Dau c 1.02 antibodies in roots. Most ofthe plants developed as wild type carrots and no phenotypical changes were detected. Only intwo independent lines morphological changes of the leaves were noticed. These changes arepresumably artifacts of the insertion.The analysis of the resistance stage showed that the hypoallergenic carrots are not moresusceptible to the plant pathogen Alternaria dauci, Alternaria radicina and Botrytis cinereathan wild-type carrots. These tree funguses cause the largest agronomical damages in carrotcrop. No up-regulation of Dau c 1 isoforms was detected after a Alternaria radicinachallenge. This can result from the fact that these necrotrophic funguses do not activate thesalicylic acid-dependant (SA) defense of the plant which verifiably induces the PR10transcription. The unimpaired colonisation of the RNAi-plants suggests that the Dau c 1isoforms do either not participate in the defense of the tested pathogens or that related PRproteins have a compensatory function in the Dau c 1.01 / Dau c 1.02 suppressed carrots. Thelatter is more probable as the resistance analyses indicated a compensation by the proteinsDcPRPlike1 and PR3. A SA-treatment of the leaves was able to prove that the Dau c 1isoforms in the hypoallergenic carrots were inducible by SA. The SA-treatment showed anup-regulation of the respective non-suppressed isoform.Skin-prick-tests with RNAi-carrots performed with patients showed a reduced allgenicskin reaction with patients who were monosensitized against one of the two Dau c 1 isoforms.A clearly reduced IgE-reaction with the Dau c 1.01-suppressed carrot-protein-extracts againstthe Dau c 1-protein were detected in the IgE binding reactions with sera of patients. Further,not yet characterized, high-molecular carrot proteins were detected in the IgE bindingreactions against Dau c 1 isoforms.