Experimente zur Regulation der Epstein Barr Virus (EBV) DNA-Polymerase BALF5 durch die EBV-kodierte mikroRNA BART2

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2008

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-12261

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Aus Studien der Gruppe um Tuschl wurden im Jahre 2004 fünf EBV-kodierte mikroRNAs nachgewiesen. In computergestützten Verfahren wurden entsprechende Ziel-mRNAs vorhergesagt. In der vorliegenden Arbeit wird der funktionelle Einfluß der miRNA BART2 auf ihre Ziel mRNA BALF5 (virale DNA-Polymerase) untersucht. Diese ist vollständig komplementrär zur miRNA, was darauf schließen lässt, dass durch die miRNA-BART2 eine Spaltung der BALF5 mRNA hervorgerufen wird. Zunächst soll eine Verringerung der Proteinmenge nachgewiesen werden. Hierzu wurden zunächst entsprechende Reporter- (pGL3-BALF5) und Effektorkonstrukte (pSG5-BART2) hergestellt für Luciferase-Reporter-Assays. Diese Konstrukte konnten einen Nachweis zur Herabregulierung der Proteinmenge um etwa 44% erbringen.Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Gewinnung und Charakterisierung monoklonaler BALF5-Antikörper. Die DNA-Polymerase von EBV ist Ziel der miR-BART2 und somit ist es wichtig, auch auf Proteinebene einen Einfluß der miRNA nachzuweisen. Nach Immunisierung von Ratten durch Frau Dr. Kremmer (GSF, München) mit einem BALF5-Peptid konnten verschiedene Antikörper-Klone charakterisiert werden. Vor allem der Klon 4C12 eignet sich sehr gut für weitere Versuche, denn er zeigt neben einer spezifischen Antigen-Antikörperreaktion in der Immunpräzipitation und der Immunfluoreszenz wie die Antikörper 2D6, 4D10, 2E10, 7E6 und 6G7 auch eine spezifische Erkennung des BALF5-Proteins in der Western Blot-Analyse.Abschließend wurde mit den erhaltenen BALF5-Antikörpern versucht, einen indirekten Nachweis der Induktion des lytischen Zyklusses zu erbringen, der durch das Abfangen von miRNAs ausgelöst werden sollte. Allerdings war es mit den hier verwendeten Methoden nicht möglich, eine lytische Replikation von EBV auszulösen, welche indirekt über das Auftreten des early genes des lytischen Zyklusses, BALF5, nachzuweisen ist. Dies wäre von Interesse im Hinblick auf neue Ansätze in der Therapie der von latenten EBV-ausgelösten lymphoproliferativen Erkrankungen.

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