Charakterisierung der Genotypen 2 bis 8 des Hepatitis-D-Virus (HDV)

Abstract

Eine Infektion mit dem Hepatitis-D-Virus (HDV) kann akut oder chronisch verlaufen, nimmt aber in den meisten Fällen einen deutlich schwereren Verlauf als eine Hepatitis B-Monoinfektion. Insbesondere in einkommensschwachen Ländern ohne flächendeckende Screening- und Impfprogramme oder suffizienter medikamentöser Therapie ist die chronische HDV-Infektion eine große medizinische Belastung für den öffentlichen Gesundheitssektor. Obwohl heute 8 verschiedene HDV Gt bekannt sind, wird die molekularbiologische Forschung an HDV weiterhin überwiegend mit einem einzelnen Isolat des Gt 1 durchgeführt. Klinische Daten zeigen aber, dass die Krankheitsausprägung zwischen den verschiedenen Gt unterschiedlich ausfallen kann. Dies mag vielfältige Ursachen haben, die höchstwahrscheinlich nicht allein in der Genomvariabilität von HDV begründet liegen. Zudem zeigen die derzeit verfügbaren etablierten HDV-RNA-Screening-Assays große Unterschiede in der diagnostischen Sensitivität und Spezifität und unterschätzen insbesondere bei den afrikanischen Gt 5-8 häufig die tatsächliche Viruslast. Um das Verständnis und die Forschung der verschiedenen, insbesondere selteneren HDV Gt und die damit verbundenen klinischen Fragestellungen voran zu bringen, sollte in dieser Dissertation eine Charakterisierung der HDV Gt 2-8 erfolgen. Zunächst wurden hierfür entsprechende HDV Vollgenomplasmide hergestellt. Die Sequenz eines jeden Gt wurde öffentlichen Datenbanken entnommen und die Klonierung erfolgte in den Vektor pcDNA3.1+. Nachfolgend wurden die Vollgenomplasmide in Huh-7 Zellen transfiziert. Mittels Immunfluoreszenz konnte im Anschluss für jeden der Gt erfolgreich der Nachweis der HDAg-Expression erbracht werden. Die Differenzierung zwischen S- und L-HDAg Expression wurde für jeden klonierten HDV Gt dargestellt, was als Beleg für eine stattfindende autonome Virusreplikation gewertet werden konnte. HDV-Partikel wurden in vitro hergestellt, indem die HDV-Vollgenomplasmide mit einem Expressionsplasmid für S-, M- und L-HBsAg des HBV Gt D3 in Huh-7 ko-transfiziert wurden. Der Zellkulturüberstand zeigte nach qRT-PCR für jeden Gt hohe HDV-RNA-Level zwischen 1,03x106 - 9,05x106 GE/ml. Abschließend wurde mit diesen HDV-haltigen Zellkulturüberständen ein Infektionsnachweis erbracht. Hierfür wurden HepG2-NTCP Zellen mit den Virusüberständen der HDV Gt 2-8 infiziert und im Anschluss eine Immunfluoreszenz durchgeführt. Diese zeigte bei fast allen der sieben Gt eine Infektions abgeleitete HDAg-Expression in den Leberzellkernen, wobei die Infektiosität der HDV Gt 4 und 6 nicht abschließend geklärt werden konnte. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass in dieser Arbeit funktionsfähige HDV-Vollgenomplasmide der Gt 2-8 kloniert wurden, die imstande sind, in vitro rekombinante HDV-Partikel zu exprimieren.