Das vaskuläre RNA/RNAse-System : Funktionelle Aktivität synthetischer Nukleinsäuren und extrazelluläre RNase1 als neuer vaskulärer Regulator

Abstract

Extrazelluläre Ribonukleinsäuren (RNA), vor allem freigesetzt als Folge von Gewebsverletzungen, wurden von unserer Arbeitsgruppe als prokoagulatorischer und proinflammatorischer Faktor im vaskulären System identifiziert. Hierbei dient RNA einerseits über die Bindung an Proteine des intrinsischen Gerinnungsweges (Faktor XI, Faktor XII, Präkallikrein, hochmolekulares Kininogen) als effizienter Kofaktor für deren Autoaktivierung und führt zur Ausbildung eines stabilen Thrombus. Andererseits induziert extrazelluläre RNA über die Aktivierung des vaskulär-endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (VEGF-R2) den Anstieg des intrazellulären Kalzium-Spiegels. Dies resultiert in einer Hyperpermeabilität des Endothels und der Ausbildung zerebraler Ödeme in vivo. Diese Effekte wurden in vivo durch die Applikation von Ribonuklease 1 (RNase 1), aber nicht mit Desoxyribonuklease (DNase), in entsprechenden Tiermodellen signifikant blockiert.Bislang gab es keine Hinweise, ob spezifische Strukturmerkmale für die physiologischen Effekte extrazellulärer Nukleinsäuren verantwortlich sind. Daher wurde in der hier vorliegenden Arbeit die prokoagulatorische Aktivität und die Stabilität verschiedener synthetischer Desoxyribonukleinsäure- (DNA) und RNA-Oligonukleotide in humanem Plasma sowie in isolierten Systemen in Abhängigkeit zu strukturellen Charakteristika untersucht. Hierbei waren Oligonukleotide mit stabiler Haarnadelsekundärstruktur (1) stärker vor der Degradierung durch Nukleasen geschützt, (2) effiziente Kofaktoren bei der Auto-Aktivierung von Präkallikrein im isolierten System und (3) prokoagulatorisch in humanem Plasma. Über Bindungsexperimente mit verschiedenen DNA-Oligonukleotiden wurden die stärksten Wechselwirkungen zwischen prokoagulatorisch aktiven Haarnadelstrukturen und hochmolekularem Kininogen (KD=1,82 µM), einem nicht-enzymatischen Kofaktor bei der Aktivierung von Präkallikrein und Faktor XI, charakterisiert. Ebenso zeigten synthetische, therapeutisch verwendete Nukleinsäuren (Aptamere) deutliche prokoagulatorische Eigenschaften. Die systemische Applikation von Aptameren könnte somit von thrombotischen und inflammatorischen Komplikationen begleitet werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass kurze Haarnadel-enthaltende Nukleinsäurestrukturen über die spezifische Bindung an Kininogen die Aktivierung des intrinsischen Gerinnungsweges vermitteln können. Dies erweitert unsere Kenntnisse bezüglich der Interaktion zwischen Gerinnungsproteinen und Nukleinsäuren, die bisher lediglich auf deren Größe und negative Ladung zurückgeführt wurden. In diesem Zusammenhang wurde Plättchenfaktor 4 (PF4), ein basisches Chemokin, das bei der Aktivierung von Thrombozyten aus den alpha-Granula freigesetzt wird, als neues Nukleinsäure-bindendes Protein identifiziert. Aufgrund seiner starken Bindung an zelluläre und synthetische Nukleinsäuren neutralisiert PF4 deren prokoagulatorische Aktivität und beeinflusst somit als neuer Regulator das Ausmaß der intrinsischen Blutgerinnung.Zirkulierende RNasen erfüllen als effiziente Gegenspieler der verschiedenen durch extrazelluläre RNA initiierten Prozesse im Gefäßsystem protektive Aufgaben. Hierbei ist insbesondere die Regulation der in Endothelzellen exprimierten RNase 1 unter inflammatorischen und prokoagulatorischen Bedingungen von Bedeutung. Eine signifikante Verminderung der RNase 1-Expression im Endothel wurde nach Stimulation mit Tumornekrosefaktor alpha (TNF-alpha) oder Thrombin detektiert, während Lipopolysaccharide keinen Effekt hatten. Der Einfluss der Agonisten war dabei reversibel, sodass die Expression von RNase 1 nach Entfernen des Stimulus wiederhergestellt wurde.Die Herunterregulation von RNase 1 durch TNF-alpha oder RNase 1-siRNA bewirkte eine Zunahme der endothelialen Permeabilität, da das unter Kontrollbedingungen in den adherens junctions exprimierte VE-Cadherin eine veränderte, teilweise cytosolische Lokalisierung zeigte. Die Analyse der beteiligten Signalwege, die zur Erniedrigung der RNase 1 Expression nach TNF-alpha-Behandlung in Endothelzellen führte, schloss einen NFkappaB-abhängigen Regulationsmechanismus aus. Vielmehr implizierte die Wiederherstellung der RNase 1-Expression durch Inhibierung der Histondeacetylasen mit Trichostatin A, dass die TNF-alpha-bedingte erniedrigte Expression von RNase 1 über Veränderungen im Acetylierungsstatus beteiligter Proteine reguliert wird.Die vorliegende Arbeit zeigt, dass eine genaue Regulation des RNA/RNase 1-Gleichgewichtes auf mRNA wie auch auf Proteinebene eine wichtige Rolle bei der Homöostase des vaskulären Systems spielt.

Extracellular ribonucleic acid (RNA), released particularly after tissue or vessel damage, was identified by our group as new procoagulant and proinflammatory mediator in the vascular system. RNA serves as an efficient cofactor for the auto-activation of the proteins of the intrinsic coagulation pathway (factor XI, XII, prekallikrein, high molecular weight kininogen), thereby promoting stable clot formation. Furthermore, extracellular RNA increases endothelial permeability in a vascular endothelial growth factor (VEGF)-dependent manner, resulting in enhanced cerebral edema formation in vivo. Both effects were significantly inhibited in vivo by the application of ribonuclease 1 (RNase 1) but not deoxyribonuclease (DNase) in respective pathogenic animal models.In the present study the structure-function relations of extracellular nucleic acids were characterized particularly with respect to their coagulant activities. Therefore, different deoxyribonucleic acid (DNA)- and RNA-oligonucleotides, representing diverse secondary structures, were indcluded in the analysis. The results implicate that oligonucleotides forming a stable hairpin structure (1) are better protected against the degradation by nucleases, (2) serve as effecient cofactors for the auto-activation of prekallikrein in isolated systems and (3) act as potent procoagulant cofactors in human plasma. Binding experiments with different DNA-oligonucleotides revealed specific interactions between procoagulant hairpin forming structures and high molecular weight kininogen (KD=1,82 µM), a non-enzymatic cofactor for the activation of prekallikrein and factor XI. Prominent procoagulant activities were also seen for therepeutically used nucleic acids, so called aptamers. Thus, a systemic application of these compounds could be acompanied by thrombotic or inflammatory side effects.These results implicate that nucleic acids, forming stable hairpin structures, promote the activation of the intrinsic coagulation pathway via specific binding to kininogen. This extends our knowledge of the interaction between coagulation proteins and nucleic acids, which was thought so far to depend solely on their size and negative charge.Platelet factor 4 (PF4), a basic chemokine, which is released from the a-granules of activated platelets, was identified as new nucleic acid binding protein. Based on this interaction, PF4 neutralises the procoagulant activity of cellular as well as artificial nucleic acids in a dose-dependent manner, thereby representing a new regulator of the procoagulant functions of extracellular nucleic acids.Circulating RNases, expressed in endothelial cells, represent the natural counterpart of extracellular RNA in the vascular system. In this context, the regulation of the vascular RNase 1 under inflammatory and coagulant conditions was of particular interest. A long-term treatment of human endothelial cells with tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) or thrombin revealed a significant down-regulation of RNase 1 mRNA and activity. Stimulation with lipopolysaccharids had no effect. Analysis of the endothelial barrier function revealed that the down-regulation of RNase 1 by TNF-alpha as well as the application of RNase 1-siRNA increased the permeability of the endothelial monolayer as demonstrated by rearrangement of the VE-cadherin distribution and disintegration of cellular contacts in the adherence junctions. Mechanistically, the TNF-alpha-induced decrease of RNase 1 expression was independent of the activation of NFkappaB. Yet, inhibition of histone deacetylases by trichostatin A recovered RNase 1 expression and secretion, indicating an acetylation-dependent regulation process. Furthermore, a depletion of the TNF-alpha-stimulus induced a recovery of RNase 1 expression and release in a time-dependent manner, indicative for a reversible process. These results demonstrate a down-regulation of RNase 1 on mRNA and protein level by several inflammatory stimuli including TNF-alpha, which is mediated by changes of the acetylation status. Consequently, an exact regulation of the RNA/RNase 1 balance on mRNA as well as on protein level plays an important role in the homeostasis of the vascular system.