Infektiosität und Antigenität von humanen und tierischen Hepatitis-B-Virus-Isolaten in relevanten Zellkultursystemen

Abstract

Schätzungsweise jeder vierte Mensch zeigt serologische Hinweise auf Kontakt mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV), welches spezifisch Hepatozyten infiziert und nur in diesen effizient replizieren kann. Rund 296 Millionen Menschen sind chronisch mit HBV infiziert und die chronische HBV-Infektion ist eine der häufigsten Ursachen für leberassoziierte Todesfälle weltweit. Dem zugrunde liegt eine langfristige, starke immunologische Aktivierung zur Eliminierung HBV-positiver Hepatozyten. Als Strukturproteine spielen die Oberflächenproteine des HBV (HBsAg) eine zentrale Rolle in dessen Lebenszyklus, insbesondere bei der Sekretion infektiöser Virionen sowie bei der Vermittlung des Zelleintritts über Virus-Rezeptor-Interaktionen. In chronischen Trägern werden häufig aufgrund immunologischen Drucks Mutationen in antigenen Bereichen des HBsAg selektioniert. Innerhalb dieser Arbeit wurde die Sequenzheterogenität innerhalb der viralen Quasispezies an einem Patientenserum mit zeitgleicher positiver HBV-DNA und hohem Anti-HBs-Titer untersucht. Die Mehrheit der gewonnenen Sequenzen zeigte Mutationen, die zusätzliche N-Glykosylierungsstellen alleine oder in Kombination mit bekannten Immunescape-Mutationen in der großen hydrophilen Region (MHR) des kleinen HBV-Oberflächenproteins beinhalteten. Im besonderem Maße fiel eine zuvor unbeschriebene Sechs-Nukleotidinsertion (6 nt) an Aminosäure 125 auf. Experimentell konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die drei untersuchten, nicht-kanonischen N-Sequons auch N-glykosyliert wurden und doppelt-glykosyliertes SHBs am effizientesten von humanen Hepatomzellen sekretiert werden konnte. Detektierbarkeit subviraler Partikel aus HBsAg der T131N/M133T- und der 6 nt-Variante durch diagnostische HBsAg-Assay war um >90 % gesenkt und auch Reaktivität dieser HBsAg-Varianten mit Anti-HBs aus Seren nach HBV-Impfung bzw. -Genesung um >90 % reduziert. Die zentrale Rolle der viralen Oberflächenproteine (HBsAg) für Sekretion, Antigenität und Infektiosität von Hepadnaviren wurden in dieser Arbeit auch bei drei neuentdeckten Orthohepadnaviren aus Eseln und Zebras (Familie der Pferde, Equidae, EqHBV) und Spitzmäusen (CSHBV, MSHBV) untersucht. Das HBsAg der neuartigen Orthohepadnaviren zeigte keinerlei Kreuzreaktivität mit einem polyklonalen HBV-Impfstoff-Antiserum und nur bei zwei monoklonalen Anti-HBs-Antikörpern (HB01, H166) konnte eine Kreuzreaktivität mit MSHBV, nicht jedoch mit EqHBV, festgestellt werden. EqHBs- und MSHBs-/CSHBs-pseudotypisierte HDV (psHDV) konnten in menschlichen Zellen produziert werden. Diesen psHDV war es nicht möglich, über das NTCP/Ntcp des Menschen bzw. ihrer Wirtsspezies in vitro zu infizieren. Dementgegen konnten Infektionsereignisse von psHDVEqHBV-Ze nach Infektion von primären Pferde-hepatozyten nachgewiesen werden. Eine Infektion von primären humanen Hepatozyten war durch psHDVEqHBV nicht möglich. Auf Grundlage der hier präsentierten Daten, scheint die Verwendung des NTCP/Ntcp für den Zelleintritt und ein zoonotisches Potential der neuartigen Orthohepadnaviren aus Equiden und Spitzmäusen demnach sehr unwahrscheinlich. Außerdem wurde die Konservierung der Antigenität des HBcAg und die Prozessierung des sequentiell-verwandten HBeAg für diese drei neuentdeckten Orthohepadnaviren untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass polyklonale Anti-Core-Antikörper zum Teil eingeschränkte Kreuzreaktivität mit Core-Proteinen der neuartigen tierischen Orthohepadnaviren zeigten. Die Prozessierung und Sekretion des HBeAg, welches für die Etablierung chronischer Infektionen von großer Bedeutung ist, wurde bioinformatisch und experimentell untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass essentielle Prozessierungsmerkmale des HBeAg im EqHBV konserviert waren und dieses auch als sekretiertes Protein im diagnostischen Assay nachweisbar war. Die untersuchten CSHBV- und MSHBV-Isolate hingegen scheinen kein funktionales HBeAg zu kodieren, da wichtige Grundlagen für eine erfolgreiche Prozessierung des HBeAg-Vorläuferpolypeptids fehlten. Die Etablierung von chronischen Verläufen als wesentliches Kennzeichen von hepadnaviralen Infektionen erscheint daher bei Spitzmäusen zumindest fraglich.