Untersuchung des möglichen Einflusses von Umweltchemikalien auf die lymphatischen Organe von Schweinswalen aus der Nord- und Ostsee sowie dem Atlantik unter besonderer Berücksichtigung der Zytokin-Expression

Abstract

1. Neben hohen Beifangzahlen und einem verminderten Nahrungsangebot sind die Schweinswale der Deutschen Nord- und Ostsee durch die zunehmende Häufigkeit bakterieller und parasitärer Erkrankungen gefährdet. Weiterhin akkumulieren die Wale große Mengen an organischen und anorganischen Schadstoffen. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den möglichen Zusammenhang zwischen der Schadstoffbelastung und Veränderungen im Immunsystem der Schweinswale zu untersuchen. 2. Im Literaturteil wird die Taxonomie und Ökologie sowie die aktuelle Situation der Schweinswale in der Nord- und Ostsee dargestellt. Weiterhin werden Studien zur zellulären und humoralen Immunantwort sowie zur Immuntoxizität bei marinen Säugetieren beschrieben. Neben morphologischen Aspekten werden pathologische Veränderungen der lymphatischen Organe verschiedener Wal- und Robbenarten berücksichtigt. Abschließend wird der gegenwärtige Stand der Forschung auf dem Gebiet der Immunphänotypisierung lymphatischer Zellen und der Zytokine bei Meeressäugetieren erläutert. 3. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden 26 monoklonale (mAK) und ein polyklonaler Antikörper (mAK) unterschiedlicher Spezies auf ihre immunhistologische Kreuzreaktivität mit gefrorenen und Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten lymphatischen Geweben des Schweinswales getestet. T-Lymphozyten wurden durch einen mAK und pAK Anti-CD3-Antikörper sowie durch zwei monoklonale walspezifische Anti-CD2-Antikörper markiert. Ein walspezifischer CD45R-Marker zeigte eine starke Reaktion auf B-Lymphozyten, während T-Lymphozyten eine schwache Reaktion aufwiesen. MHC Klasse II-Antigen, welches durch einen bovinen und walspezifischen mAK erkannt wurde, fand sich auf T- und B-Lymphozyten. Ein kaniner MHC Klasse II-spezifischer mAK reagierte mit Oberflächenantigenen von Antigen-präsentierenden Zellen und B-Lymphozyten. Ein equiner Pan-Leukozytenmarker erkannte die meisten Zellen der T- und B-Zellkompartimente. 4. Zur Untersuchung der zellulären Immunantwort wurden periphere Blutlymphozyten von vier Schweinswalen isoliert. Nach Inkubation mit Concanavalin A (Con A), Phytohämagglutinin (PHA) und pokeweed mitogen (PWM) wurde die Zellproliferation durch BrdU-Inkorporation photometrisch gemessen. Con A und PHA stellten die effektivsten Mitogene dar, während PWM eine vergleichsweise geringe Proliferation der Lymphozyten induzierte. 5. Mittels RT-PCR wurde die Genexpression ausgewählter Zytokine und des Haushaltsgens GAPDH im Lymphozytenstimulationstest untersucht. Durch die selektierten Primer konnte die mRNS von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TGF-beta und TNF-alpha in Con A und PWM-stimulierten Zellen detektiert werden. In PHA-stimulierten Zellen konnte keine IL-2-mRNS nachgewiesen werden. IL-10 und GAPDH fanden sich in unstimulierten und stimulierten Zellen. Die Spezifität der Amplifikate wurde durch die DNS-Analyse bestätigt. 6. Gegenstand der Hauptuntersuchungen waren 61 gestrandete und beigefangene Schweinswale aus der Nord- und Ostsee sowie aus isländischen und norwegischen Gewässern. Für die histologische Befunderhebung wurden Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete, HE-gefärbte Gewebsschnitte verwendet. Die Gradierung der Thymusatrophie und Milzdepletion erfolgte anhand morphologischer Kriterien. Weiterhin wurde der Gesundheitsstatus der Tiere aufgrund des Ernährungszustandes und der pathologischen Veränderungen ermittelt. Durch toxikologische Analysen wurden die PCB-, PBDE-, Toxaphen-, DDE- und DDT-Konzentrationen im Fettgewebe quantifiziert. 7. Der Respirationstrakt wies die häufigsten, pathologischen Befunde auf. Gestrandete Schweinswale zeigten einen schlechteren Ernährungs- und Gesundheitszustand als beigefangene Tiere. Weiterhin fand sich eine positive Korrelation zwischen der Thymusatrophie bzw. Milzdepletion und erhöhten PCB- und PBDE-Konzentrationen. Zusätzlich bestand ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Depletion beider Organe und dem Gesundheits- bzw. Ernährungszustand. 8. Mittels Immunhistologie wurden unterschiedlich stark depletierte Thymi und Milzen von 29 Tieren phänotypisch charakterisiert. Zusätzlich wurde mittels semiquantitativer Echtzeit-RT-PCR die Zytokin-Expression in diesen Organen und dem Blut der Tiere gemessen. 9. Die Thymusatrophie war mit einer Depletion der CD2+/CD3epsilon+-Zellen vergesellschaftet. In hochgradig atrophischen Thymi fand sich mit dem bovinen Antikörper eine kortikale MHC Klasse II-Aufregulation. Weiterhin war die Thymusatrophie mit einem Verlust der medullären CD45R- und MHC Klasse II-exprimierenden Zellen verbunden. Die Milzdepletion war durch einen Zellschwund in den Follikeln und der Marginalzone, ohne phänotypische Veränderungen charakterisiert. Jedoch fand sich in der PALS ein selektiver Verlust der CD2+- und CDepsilon+-Lymphozyten. 10. Mittels Echtzeit-RT-PCR konnte mit zunehmender Atrophie eine verminderte Expression von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 und TNF-alpha im Thymus nachgewiesen werden, jedoch zeigte lediglich die Reduktion von IL-6 einen signifikanten Zusammenhang. Die Zytokin-Expression in der Milz wies keine eindeutige Verbindung mit der Depletion auf. In einzelnen intakten und hochgradig depletierten Organen konnte jedoch eine Aufregulation von IL-6, TNF-alpha und TGF-beta festgestellt werden. 11. Die mRNS-Menge von IL-10 im Blut wies einen signifikanten Zusammenhang mit der Milzdepletion auf. Es konnte keine eindeutige Korrelation zwischen der Thymusatrophie und den Zytokinen im Blut festgestellt werden. Jedoch wiesen drei Schweinswale mit hochgradiger Thymusatrophie eine deutliche IL-6-Aufregulation auf. 12. Mit zunehmender Thymusatrophie wird ein T-Zellverlust beobachtet. Die immunphänotypischen Veränderungen sprechen für eine Depletion der unreifen, kortikalen Thymozyten. Weiterhin ist die Reduktion medullärer B-Lymphozyten möglicherweise mit einer gestörten Thymopoese vergesellschaftet. Die Depletion der T- und B-Zellkompartimente in der Milz sowie der selektive Verlust von T-Lymphozyten in der PALS kann als eine Suppression ortständiger Zellen oder eine gestörten Migration aus primären lymphatischen Organen interpretiert werden. 13. Die semiquantitative Echtzeit-RT-PCR stellt ein sensitives Verfahren für den Zytokin-Nachweis dar. Die ausgewählten Zytokine spielen eine Rolle in der Thymopoese und Immunantwort der Schweinswale und der mögliche Zusammenhang mit der Thymusatrophie bzw. Milzdepletion wird diskutiert. Möglicherweise induziert die IL-10-Aufregulation im Blut eine lymphozytäre Suppression in der Milz der untersuchten Wale. 14. Die Untersuchungen unterstützen die Hypothese eines negativen Einflusses von PCB und PBDE auf das Immunsystem der Schweinswale. Jedoch müssen bei der Interpretation weitere immunsuppressive Faktoren wie chronische Erkrankungen und Kachexie der Tiere, welche ebenfalls zu einer lymphozytären Depletion führen können, berücksichtigt werden.

1. The harbor porpoises in the German North and Baltic Seas represents an endangered species due to high by-catch rates, depletion of food sources, and a growing incidence of bacterial and parasitic diseases. As a top predator, whales accumulate environmental contaminants. The aim of the present study was to investigate the possible influence of xenobiotics on the immune system of harbor porpoises. 2. Taxonomy, ecology, and the current status of harbor porpoises in the North and Baltic Seas is reviewed in the literature section. Additionally, investigations upon the cellular and humoral immune response, as well as upon the immunotoxicity in marine mammals are described. Special emphasis is given to the morphology and pathological changes in lymphoid organs of different cetacean and pinniped species. Finally, techniques for immunophenotyping of lymphoid cells and detection of cytokines in marine mammals are described. 3. In the first part of the study 26 monoclonal antibodies (mAb) and one polyclonal antibody (mAb) of different species were tested for immunohistochemical cross-reactivity on frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded lymphatic tissues of the harbor porpoise. T-lymphocytes were labeled by a mAb and a pAb directed against the CD3 complex and by two cetacean mAb specific for CD2 antigen. CD45R, labeled by a cetacean mAb, was strongly expressed on B and weakly on T cells. MHC class II antigen, recognized by cetacean and bovine-specific mAbs, was expressed on T and B cells. A canine MHC class II-specific mAb recognized an epitope on the surface of antigen-presenting cells and B lymphocytes. An equine-pan-leukocyte marker labeled the majority of cells in B- and T-cell compartments. 4. To investigate the cellular immune response of peripheral lymphocytes, blood cells were isolated from four harbor porpoises. After concanavalin A (Con A)-, phytohemagglutinin (PHA)-, and pokeweed mitogen (PWM)-stimulation cell proliferation was measured photometrically using BrdU-assay. Con A and PHA were the most effective mitogens, while PWA induced only a comparatively low proliferation. 5. Gene expression of selected cytokines and the housekeeping gene GAPDH in the lymphocyte transformation test was investigated by RT-PCR. Using specific primers IL-2-, IL-4-, IL-6-, IL-10-, TGFbeta-and TNFalpha-cDNA were amplified in Con A- and PWM-stimulated cells. IL-2 was not detected in PHA-activated cells. The mRNA of IL-10 and GAPDH was expressed in non-stimulated and stimulated cells. Additionally, specificity of PCR-products was confirmed by sequence analysis. 6. Sixty one by-caught and stranded harbor porpoises from the North and Baltic Seas, as well as from Icelandic and Norwegian waters were investigated. Histological examination was performed on formalin-fixed, paraffin-embedded and HE-stained tissue sections. Grading of thymic atrophy and splenic depletion was based on morphological criteria. Additionally, the nutritional state and health status of harbor porpoises was determined. Body burden of PCB, PBDE, toxaphen, DDE and DDT was quantified by toxicological analysis. 7. The most severe pathological findings were demonstrated in the respiratory tract. In comparison to by-caught harbor porpoises, most stranded animals showed a poor nutritional state and health status. Furthermore, thymic atrophy and splenic depletion was positively correlated to increased PCB- and PBDE-concentrations. In both organs lymphoid depletion was correlated with a poor nutritional state and health status. 8. Phenotypical changes in thymus and spleen of 29 harbor porpoises were investigated using immunohistochemistry. Furthermore, cytokine expression in these organs and the blood was measured using semiquantitative real-time RT-PCR. 9. Thymic atrophy was associated with a depletion of CD2+/CD3epsilon+-cells. Using the bovine mAb a cortical MHC class II-up-regulation was found in severely atrophic thymuses. Furthermore, thymic atrophy was correlated to a decrease of medullary CD45R- and MHC class II-expressing cells. Splenic depletion was characterized by cellular loss in follicles and the marginal zone, without phenotypical changes. However, in the PALS a selective loss of CD2+- and CD3epsilon+-lymphocytes was demonstrated. 10. Using real-time RT-PCR a loss of IL-2, IL-4, IL-6, Il-10 and TNF-alpha expression was demonstrated in atrophic thymuses. However, only down-regulation of IL-6-mRNA was statistically significant. Cytokine expression in the spleen showed no association with lymphoid depletion, and in few normal and severely depleted organs a marked up-regulation of IL-6, TNF-alpha and TGF-beta was found. 11. Splenic depletion was significantly associated with an up-regulation of IL-10 in the blood. No definite correlation was found between cytokine expression and thymic atrophy. However, in three animals with severe thymic atrophy high levels of IL-6 were found in the blood samples. 12. Thymic atrophy of the harbor porpoise is associated with a loss of T cells predominantly in the cortex. Furthermore, immunophenotypical changes demonstrated a depletion of immature cortical thymocytes. Reduction of medullary B cells may be associated with diminished thymopoiesis. Additionally depletion of splenic T and B cell compartments can be interpreted due to suppression of splenic stem cells or a failure of immigration from primary lymphoid organs. 13. Semiquantitative real time RT-PCR is a sensitive method for the detection of cytokines. The possible role of selected cytokines in the thymopoiesis and the immune response as well as the possible interaction with the observed lymphoid depletion in harbor porpoises is discussed. Up-regulation of IL-10 in the blood may induce a splenic suppression in the investigated harbor porpoises. 14. The results of the present investigation indicate a potential negative influence of PCB and PBDE upon the immune system of harbor porpoises. However, other immunosuppressive factors, such as chronic illness and emaciation can lead to similar changes in lymphoid organs of the animals.