NFkappa B, Caspase 3 und Cytochrom c Oxidase : Licht- und elektronenmikroskopische, immunhistochemische sowie biochemische Untersuchungen am GalN/TNF-Alpha-Modell der Maus
Ziel dieser kinetischen Studie war die Untersuchung der Veränderungen der Hepatocyten von GalN sensibilisierten TNF-a-behandelten Mäusen in einem Zeitraum von 48 Stunden. Der apoptotische Effekt von TNF-a wurde durch die Blockierung der Synthese cytoprotektiver Proteine mittels GalN erzielt. Diese Proteine verhindern physiologisch eine von TNF-a induzierte Apoptose. Besonderer Wert wurde auf die Untersuchung der hepatozellulären Apoptose gelegt.
Im ersten Teil der Arbeit wurden in Form einer Literaturübersicht die Morphologie und die Mechanismen der Apoptose beschrieben. Weiterhin wurde auf einige Proteine, die an diesem Prozeß beteiligt sind, näher eingegangen, wobei der Transkriptionsfaktor NF-kB und sein Inhibitor I-kB im Vordergrund stehen.
In diesen Untersuchungen wurde Mäuselebergewebe nach einer standardisierten Perfusionsfixierung mit 4% Paraformaldehyd oder 0,25% Glutaraldehyd fixiert und in unterschiedlichen Medien für Licht-, Elektronen-, Fluoreszenzmikroskopie und für Immunhistochemie eingebettet.
Durch die elektronenmikroskopische Untersuchung konnten die präapoptotische und apoptotische Veränderungen der Mitochondrien und des Zellkernes dargestellt werden. 3 1/2 Stunden nach GalN/TNF-a Behandlung zeigten apoptotische Hepatocyten Mitochondrien mit einer Ruptur der äußeren Membran, durch die die innere Membran in Form einer Hernie hervorquoll. Ebenfalls traten die Veränderungen im Zellkern auf, die durch Chromatinkondensierung am Kernrand und schließlich 4 1/2 Stunden nach GalN/TNF-a Behandlung durch Bildung der apoptotischen Körperchen charakterisiert werden.
Nekrosen wurden vermehrt nach acht Stunden identifiziert und begleiteten dabei die apoptotischen Veränderungen, die ihrerseits nach 24 Stunden verschwanden. Nach 48 Stunden waren kaum noch nekrotische Herde sichtbar und als ein Zeichen der Leberregeneration traten vereinzelt Mitosen auf.
Der nukleäre Transkriptionsfaktor-kB (NF-kB) befindet sich in inaktiver Form an Proteine der I-kB Familie gebunden im Cytoplasma. Eine Aktivierung mit anschließender Translokation in den Zellkern wurde durch TNF-a erreicht. Die Aktivierung von NF-kB wurde 30 min nach Behandlung immunhistochemisch und mittels Western-Blotting nachgewiesen. Die Tendenz war bis 2 1/2 Stunden steigend. Danach nahm NF-kB ab, war aber nach 4 1/2 Stunden im Zellkern mit 30% im Vergleich zu den Kontrollen immer noch stark erhöht.
Die Inhibtorproteine I-kBa und I-kBb sind als Regulatoren des Transkriptionsfaktors, obwohl sie der gleichen Familie zugehören, in ihrer Zusammensetzung und Funktion doch sehr verschieden. Während I-kBa instabil ist, was die Komplexbildung mit NF-kB betrifft, ist die Verbindung NF-kB/I-kBb durch die Maskierung beider NLS-Sequenzen ('nuclear localization signal') wesentlich stärker. I-kBa konnte dementsprechend schon nach 30 min im Kern nachgewiesen werden, I-kBb hatte dagegen bis 4 1/2 Stunden nach Behandlung eine ausschließlich cytoplasmatische Lokalisation.
Nach 3 1/2 Stunden stieg die Caspase 3-Aktivität um das fünffache im Vergleich zu den Kontrolltieren an.
Die Messung der Cytochrom c Oxidase-Aktivität in der mitochondrialen Fraktion bestätigte die licht- und elektronenmikroskopischen Ergebnisse. Sie fiel 2 1/2 Stunden nach Behandlung ab, was durch eine erhöhte Permeabilität der inneren Mitochondrienmembran erklärt wurde. Ein Anstieg nach 4 1/2 Stunden wurde auf das Nachlassen der TNF-a-Wirkung und der Aktivierung der Atmungskette zurückgeführt. Die nekrotischen Veränderungen verursachten nach 8 Stunden ein erneutes Absinken der Cytochrom c Oxidase-Aktivität. Die Regeneration der Hepatocyten wurde nach 48 Stunden durch ein erneutes Ansteigen dieser, charakterisiert. Zu diesem Zeitpunkt war sie sogar höher als in den Kontrollen.
Dies unterstreicht den Zusammenhang zwischen GalN/TNF-a induzierten Effekten: auf der einen Seite die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB und der 'Kampf' der Zelle ums Überleben mit dem Anstieg der Cytochrom c Oxidase-Aktivität, auf der anderen Seite die Apoptose mit ihren morphologischen Veränderungen, der Aktivierung der Caspase 3 und der Einleitung des Zelltodes.
Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigen, dass die Translokation von NF-kB zurück in das Cytoplasma nach GalN/TNF-a-Behandlung gestört ist. Ungefähr 30% von NF-kB verbleibt in den Zellkernfraktionen und wurde ausschließlich im Heterochromatin apoptotischer Hepatocyten nachgewiesen. Außerdem war das Erscheinen der apoptischen Hepatocyten mit einem enormen Anstieg der Caspase 3-Aktivität verbunden.
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