Expression und Funktion des Ribonuklease Inhibitors RNH1 und der Ribonukleasen Angiogenin und Ribonuklease 1 in Tumor- und Endothelzelllinien unter hypoxischen, inflammatorischen und apoptotischen Bedingungen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von Ribonuklease Inhibitor (RNH1) und dessen Interaktionspartner, Ribonuklease 1 und 4 (RNase 1/RNase 4) und Angiogenin (= RNase 5), auf mRNA- und Proteinebene in Endothel- (EA.hy926) und Tumorzellen (HT1080) mittels semiquantitativer PCR, Western-Blots und Aktivitätstests untersucht. Beide Zelllinien wurden für 24 h mit apoptotischen (Staurosporin), nekrotischen (Ethanol) und inflammatorischen Agonisten (Tumornekrosefaktor α (TNFα), Lipopolysaccharide) sowie Hypoxie behandelt.

Western-Blot-Analysen zeigten, dass die Stimulation beider Zelllinien mit Staurosporin, TNFα und Hypoxie die RNH1- und Angiogenin-Freisetzung aus den Zellen induzierte, während die intrazelluläre RNH1- und Angiogenin-Konzentration abnahm. Ein ähnliches Verhalten zeigte auch die RNase 1/RNase 4 unter diesen Bedingungen aber nur in den Tumorzellen. Die Freisetzung des RNH1 und Angiogenins erfolgte nicht nur frei in den Zellüberstand, sondern ein Anteil von RNH1 und Angiogenin (nicht aber der RNase 1/RNase 4) war, besonders unter hypoxischen Bedingungen, mit der Mikrovesikelfraktion assoziiert.

Die erhöhte Mikrovesikelfreisetzung unter inflammatorischen und hypoxischen Bedingungen korrelierte mit einem gesteigerten Ribonukleinsäure- (RNA-) sowie RNH1-Gehalt der Mikrovesikel.

Die 24-stündigen Behandlungen der Zellen mit Ethanol, Lipopolysacchariden und Hypoxie hatten keinen Einfluss auf die Genexpression von RNH1 und RNase 1. Unter hypoxischen Bedingungen nahm die mRNA-Expression von Angiogenin in den Tumorzellen zu, während in den Endothelzellen keine signifikante Änderung beobachtet wurde. Die Stimulation der Endothelzellen mit TNFα zeigte keine Wirkung auf die Genexpression von RNH1 und Angiogenin. Im Gegensatz dazu wurde die Expression, Freisetzung und Aktivität von RNase 1/RNase 4 auf Protein- und Genebene reduziert.

Um den Einfluss der RNH1-Expression auf die Expression von RNasen in Tumor- und Endothelzellen zu untersuchen, wurden RNH1-Knockdown-Experimente mit siRNA durchgeführt. In beiden Zelllinien führte die Herunterregulation der RNH1-Expression zur Abnahme sowohl der mRNA-Expression als auch der intrazellulären Konzentration von RNase 1/RNase 4 und Angiogenin. Außerdem wurde dadurch die Zunahme der RNase-Aktivität sowie des RNA-Gehalts in den Zellüberständen induziert. Die gleichzeitige Abnahme der Anzahl der lebenden transfizierten Zellen bestätigte die zytotoxische Wirkung der Herunterregulation der RNH1-Expression in diesen Zelllinien.

Des Weiteren wurde im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit der Einfluss des extrazellulären RNH1 auf unterschiedlichen Zelltypen mittels Zytotoxizitäts- und Proliferationstests untersucht. Während niedrige Konzentrationen von rekombinantem RNH1 (0,4-10 μg/ml) die Proliferation der humanen primären Endothelzellen (HUVEC) schwach und die der Tumorzellen (HT1080) stark erhöhten, wirkten höhere RNH1-Konzentrationen (40-100 μg/ml) unabhängig vom Zelltyp zytotoxisch. Zudem wurde die Wirkung von RNH1-enthaltenden Mikrovesikeln auf humane primäre Endothelzellen beobachtet. Sowohl die aus normoxisch als auch aus hypoxisch behandelten Tumorzellen (HT1080) stammenden Mikrovesikel waren zytotoxisch für HUVEC und führten zu einer signifikanten Senkung ihrer Proliferation.

Zusammenfassend lässt sich aus den gezeigten Ergebnissen schlussfolgern, dass der unter pathologischen Bedingungen aus unterschiedlichen Zelllinien freigesetzte RNH1 eine wichtige Rolle in der Viabilität von Zellen sowie in der Regulation der Gen- und Proteinexpression von RNasen und ihrer Funktion auch im extrazellulären Raum spielt.