HPV16-DNA als diagnostischer Marker in Liquid Biopsies von Patienten mit HPV16-assoziierten Oropharynxkarzinomen

Abstract

In dieser Arbeit wurden die Konzentrationen zellfreier DNA von HPV (cfHPV-DNA) in Plasmaproben von Patienten mit HPV-assoziierten und HPV-negativen Oropharynxkarzinomen untersucht. Zur Bestimmung dieser Konzentrationen wurden zwei verschiedene qPCR-Assays, SYBR Green und TaqMan, optimiert und deren Ergebnisse miteinander verglichen. Primäres Ziel der Arbeit war es, die cfHPV-DNA vor sowie nach der Tumortherapie zu messen und den Verlauf der DNA-Konzentration im Rahmen der Nachsorge zu verfolgen. Damit sollte überprüft werden, ob die Detektion von cfHPV-DNA als möglicher Biomarker im Rahmen der Nachsorge in Zukunft von Nutzen sein kann. Es konnte gezeigt werden, dass die verwendeten qPCR-Assays verglichen mit dem Goldstandard (Immunhistochemie und HPV-DNA-Analyse aus dem Tumormaterial) ebenfalls erfolgreich zur diagnostischen Unterscheidung zwischen HPV-negativem und HPV-assoziiertem OPSCC verwendet werden können. Im Hinblick auf den Konzentrationsverlauf nach erfolgter Tumortherapie zeigt sich, dass die cfHPV-DNAKonzentrationen signifikant niedriger ausfielen als vor der Therapie. Im Falle von fehlenden bildgebenden Hinweisen auf eine weiterhin bestehende Tumorerkrankung verblieb die Konzentration von cfHPV-DNA über den beobachteten Zeitraum hinweg niedrig bis nicht nachweisbar. Patienten hingegen, welche eine metastasierte Erkrankung oder ein Tumorrezidiv aufwiesen, präsentierten im Verlauf des Beobachtungszeitraums steigende cfHPV-DNA-Konzentrationen. In einzelnen Fällen zeigte sich dieser Anstieg, bevor sich der Tumorprogress im Rahmen der konventionellen Nachsorgeuntersuchung darbot. Das sekundäre Untersuchungsziel war es, den Zusammenhang zwischen der Konzentration von cfHPV-DNA und den Tumorcharakteristika, sprich TNM-Status und UICC-Stadium, zu beleuchten. Hierbei konnte mithilfe des TaqMan-Assays eine Korrelation gezeigt werden zwischen der cfHPV-DNA-Konzentration und der Tumorgröße, stratifiziert gemäß dem T-Status. Plasmaproben von Patienten mit Tumoren in der Größenkategorie T3-4 wiesen im Vergleich zur Gruppe mit T1-2 eine statistisch signifikante höhere Konzentration von cfHPV-DNA auf. Im Falle des SYBR GreenAssays erwies sich hierbei ein Trend in gleicher Richtung, jedoch ohne statistische Signifikanz. Bezüglich der weiteren Tumorcharakteristika wie N-Status, M-Status und UICC-Stadium konnte kein signifikanter Unterschied dargestellt werden. Als weiteres Untersuchungsziel der Arbeit wurden die beiden verwendeten qPCR-Assays hinsichtlich ihrer Sensitivität, Spezifität und der gemessenen Konzentrationshöhe verglichen. Hierbei wurden prätherapeutische Plasmaproben von einem Anteil der Patientenkohorte mittels beider Methoden getestet und die Ergebnisse nebeneinandergestellt. Beide Methoden wiesen eine ähnlich hohe Sensitivität und Spezifität bei der Detektion von cfHPV-DNA auf. Die mittels der TaqMan-PCR gemessenen Konzentrationen von cfHPV-DNA überstiegen hierbei um ein Vielfaches die mit dem SYBR Green-Assay gemessenen. Mittels einer Regressionsanalyse konnte jedoch gezeigt werden, dass eine hohe Korrelation der gemessenen Werte zwischen den beiden Methoden besteht (E6: R² 90,6%, p<0,001; E7: R² = 94,3%, p<0,001). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im Rahmen dieser explorativen Studie wertvolle Daten gesammelt werden konnten, welche zeigen, dass cfHPV-DNA in Liquid Biopsies ein vielversprechender Biomarker bei HPV-bedingtem OPSCC zur Überwachung des Krankheitsverlaufs und des Therapieansprechens ist. Es konnte an beispielhaften Fällen präsentiert werden, dass der Nachweis von zellfreier HPV-DNA als Indikator für das Vorliegen einer residualen Erkrankung oder eines Rezidivgeschehen dienen kann. Zu den Einschränkungen dieser Arbeit gehört unter anderem der geringe Stichprobenumfang der Kohorte und die ungleiche Verteilung der Tumorcharakteristika innerhalb dieser Kohorte. Dies ist auf die monozentrische Probensammlung im Universitätsklinikum Gießen und die niedrige Inzidenz HPV-assoziierter OPSCC zum Zeitpunkt der Probensammlung zurückzuführen. Zudem präsentierte sich die Probenabnahme im klinischen Alltag während der Nachsorgeuntersuchungen oftmals als nicht lückenfrei und in Abhängigkeit der Termine der Patienten variierten die Abnahmezeitpunkte. Zur Verifizierung der Ergebnisse dieser Arbeit und für die Etablierung von cfHPV-DNA als validen Biomarker im klinischen Alltag sind daher weitere prospektive Untersuchungen mit größeren Patientenkohorten und definierten Probenabnahmeplänen erforderlich.