Als bedeutender autokriner/parakriner Signalüberträger konnte Acetylcholin (ACh) in einer Vielzahl nicht-neuronaler Zellen nachgewiesen werden. Insbesondere Keratinozyten dienen als ein gut untersuchtes Modell des non-neuronalen cholinergen Systems (NNCS), welches an der Regulation vieler wichtiger Zellfunktionen, wie der Proliferation, Differenzierung, Migration und der Wundheilung in diesen Zellen beteiligt ist. ACh wirkt grundsätzlich auf zwei unterschiedliche Rezeptortypen, die nikotinischen und muskarinischen Acetylcholin-Rezeptoren. Muskarinische Acetylcholin-Rezeptoren (mAChRs) gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), wobei durch ihre Kopplung an bestimmte heterotrimere Guanin-Nukleotid-bindende Proteine (sog. G-Proteine) die Initiierung der mAChR-vermittelten Signaltransduktion erfolgt. Dabei koppeln die exzitatorischen M1, M3 und M5 mAChR-Subtypen bevorzugt an die Pertussis-Toxin-insensitiven Galphaq und Galpha11-Untereinheiten der trimeren G-Proteine, wobei die M2 und M4-Subtypen vorzugsweise an die inhibierenden Galphai/0-Proteinuntereinheiten gekoppelt sind. Diese Kopplung an bestimmte G-Proteinuntereinheiten ist grundlegend für die Signaltransduktion nach der Aktivierung von mAChRs. Die Interaktion von GPCRs mit der trimeren G-Proteinuntereinheit bewirkt die Aktivierung (GTP-Bindung) der alpha-Untereinheit und deren Dissoziation von der betagamma-Untereinheit des trimeren G-Proteins. Die alpha-Untereinheit und das betagamma-Heterodimer interagieren im Folgenden mit nachgeschalteten Effektoren verschiedenster Signaltransduktionswege, wobei sowohl die alpha- als auch die betagamma-Untereinheit u.a. die Aktivierung der MAPK (mitogen-activated protein kinase)-Signalkaskade vermitteln können. Die Aktivierung der M1, M3 und M5 mAChRs führt zur Aktivierung von Membran-assoziierten Enzymen, wie der Phospholipase C und Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphat-Kinase, infolgedessen Diacylglycerol und der sekundäre Botenstoff Inositol-trisphosphat gebildet und intrazelluläres Calcium mobilisiert wird. Die dadurch bewirkte Aktivierung der Proteinkinase C führt zur Ras/Raf-vermittelten Aktivierung von ERK1/2 und nachgeschalteter MAPK-Signalwege. Die Aktivierung von M2 und M4 mAChRs bewirkt wiederum die Inhibierung der Adenylatzyklase und somit die Reduktion des intrazellulären cAMP-Levels. Ebenso sind mAChRs durch einen cholinergen Transaktivierungsmechanismus von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen an der Aktivierung der MAPK-Signaltransduktion beteiligt. Dabei führt der Mechanismus des Triple-Membrane-Passing-Signalwegs (TMPS) zur mAChR-induzierten Aktivierung von Metalloproteinasen der MMP/ADAM-Familie, die zur Prozessierung von Membran-ständigen EGF-ähnlichen Liganden und letztendlich zur autokrinen und/oder parakrinen Aktivierung von epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFRs), sowie zu dessen nachgeschalter MAPK-Aktivierung führt. Die aktivierte MAP-Kinase ERK1/2 aktiviert zytoplasmatische Substrate oder nach Translokation in den Nukleus verschiedene Transkriptionsfaktoren, wie cFos und Egr1.In dieser Arbeit sollten die durch die cholinerge EGFR-Transaktivierung und Aktivierung der MAPK-Signalkaskade vermittelten transkriptionellen Effekte, welche die Expression von MAPK-Zielgenen, sowie Genen für EGF-ähnliche Liganden und Metalloproteasen der MMP- und ADAM-Familie regulieren, untersucht werden. Zusätzlich sollte eine mögliche transkriptionelle Regulation von Flotillin-Genen durch die cholinerge EGFR/MAPK-Aktivierung und der Einfluss von Flotillinen auf die transkriptionelle Regulation der untersuchten Gene näher betrachtet werden. In HaCaT-Keratinozyten führt die mAChR-vermittelte EGFR-Transaktivierung nach cholinerger Stimulation zu einer MMP/ADAM-abhängigen Aktivierung der MAPK-Signalkaskade. Anhand der quantitativen RT-PCR-Analyse wurde in diesem Kontext die CCh-vermittelte Induktion der MAPK-Zielgene Egr1, cFos und Dusp1 in HaCaT-Keratinozyten untersucht. Dabei konnte die cholinerge Induktion dieser MAPK-Zielgene gezeigt werden. Insbesondere für CCh-induzierte Egr1-Genexpression konnte eine vollständige Abhängigkeit von der mAChR-vermittelten EGFR-Transaktivierung und MAPK-Aktivierung nachgewiesen werden. Die cholinerg-induzierte Genexpression von cFos und Dusp1 wiederum wird nicht komplett durch die cholinerge EGFR-Transaktivierung vermittelt, sondern zusätzlich durch weitere cholinerg-aktivierte Signalwege unabhängig der EGFR/MAPK-Aktivierung reguliert. Die Analyse der cholinergen Induktion von Genen der EGF-ähnlichen Liganden ergab einen Anstieg der Gentranskription von TGFalpha, HB-EGF, AREG und EREG nach CCh-Stimulation von HaCaT-Keratinozyten. Für die CCh-induzierte Induktion von EREG konnte eine Abhängigkeit von der mAChR-vermittelten EGFR-Aktivierung, nicht aber von der MAPK-Aktivierung gezeigt werden, was auf eine Genregulation von EREG durch weitere cholinerg aktivierte Signalwege hinweist. Zudem wurde die cholinerge Induktion von MMPs/ADAMs untersucht, wobei die Expression von MMP-1, MMP-2, MMP-3, sowie ADAM8 und ADAM17 in HaCaT-Zellen nachgewiesen werden konnte. Die CCh-induzierte Expressionsregulation von MMP-3 zeigte zusätzlich eine deutliche Abhängigkeit von der mAChR-vermittelten Transaktivierung und des nachgeschalteten MAPK-Signalweg. Die cholinerge Induktion spezifischer EGFR-Liganden und MMPs/ADAMs weist zusätzlich auf einen feed-forward Mechanismus hin, der durch die cholinerge EGFR-Transaktivierung vermittelt wird. Dieser Mechanismus führt zu einer erhöhten Transkription von Genen, deren Genprodukte an der EGFR-Transaktivierung beteiligt sind, das wiederum durch eine vermehrte Produktion bestimmter MMPs/ADAMs und EGF-ähnlicher Liganden die Aufrechterhaltung des Transaktivierungsmechanismus fördert. Zusätzlich konnte eine cholinerge Induktion von Flotillinen auf mRNA- und Proteinebene beobachtet werden. Übereinstimmend damit konnten in vorherigen Studien Bindungsstellen für Egr1 und den Serum response Faktor (SRF) in der Promotorregion von Flotillinen identifiziert werden, wodurch die Genexpression von Flotillinen mit ERK1/2 bzw. Egr1 als bedeutende positive Transkriptionsregulatoren reguliert wird. Die Rolle von Flotillinen, insbesondere Flotillin-1, in der EGFR/MAPK-Aktivierung konnte bereits beschrieben werden, wobei in dieser Studie korrelierend damit eine deutliche Reduktion der MAPK-Zielgene Egr1 und Dusp1 durch eine Depletion von Flotillin-1 gezeigt werden konnte. Zusätzlich wurde eine Reduktion der cholinergen Induktion von HB-EGF, TGF-alpha, AREG, EREG und MMP-3 durch die Depletion von Flotillin-1 bewirkt. Eine Depletion von Flotillin-2 zeigte wiederum keinen Effekt auf die cholinerge Induktion der untersuchten Gene, was auf einen Kompensationsmechanismus des verbleibenden Flotillin-1 hinweist.
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