Die Expression des humanen GRAF-Proteins und der Tyrosinkinase FAK in soliden Tumoren des Kindesalters

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde das Signaltransduktionsprotein GRAF und dessen Interaktionspartner FAK mittels immunhistochemischer Methoden an soliden Tumoren des Kindesalters untersucht. Es handelt sich hierbei um die ersten Untersuchungen zu GRAF an soliden Tumoren des Kindesalters. Zum Nachweis von FAK wurden analog drei verschiedene Antikörper angewendet. Primär wurden 23 Fälle zu Nephroblastomen, 26 Fälle zu Neuroblastomen, 12 Fälle zu Ewing- Sarkomen und peripheren neuroektodermalen Tumoren, 18 Fälle zu Rhabdomyosarkomen und ergänzend fünf Ganglioneurome vorliegend in Form von Formalin- fixierten, Paraffin- eingebetteten Gewebeproben in Multi- Tissue Schnitten untersucht bzw. ausgewertet. Weiterhin erfolgten im direkten Fallvergleich auch Untersuchungen beider Proteine an 20 kryokonservierten Tumorgewebeproben. Außerdem wurde in den genannten Tumoren die Wachstumsfraktion mit Hilfe des MIB- 1 AK (Ki 67 Protein) untersucht und im Vgl. bei präoperativ chemotherapierten zu nicht chemotherapierten Fällen von NEP, bzw. im Vgl. zur ermittelten Mitoserate im Gesamtkollektiv und zur FAK- Expression in den verschiedenen Tumorgruppen, als auch in Bezug auf die ermittelten Überlebensdaten, ausgewertet.Zur Fragestellungu den Fragen 1) und 2) In allen Tumorgruppen konnte keine relevante Expression von GRAF auf Proteinebene nachgewiesen werden. Unter Berücksichtigung der Literatur sind hierfür ursächlich sowohl regulative bzw. die Proteinstruktur verändernde Mechanismen, wie im Rahmen der Signaltransduktion (19), als auch erniedrigte bis fehlende oder fehlerhafte Expression bedingt durch molekulargenetische Veränderungen (35), denkbar. Im fehlenden Nachweis von GRAF, welches als potentielles Tumorsuppressorgen vermutet wurde (20), könnte ein die Tumorentwicklung begünstigender Einfluss liegen. FAK war in praktisch allen untersuchten Tumorfällen mit mindestens einem der verwendeten drei AK nachweisbar, was die in der Literatur bereits beschriebene zentrale Bedeutung von FAK bei der Tumorentwicklung (27, 41-47) erneut und damit auch noch einmal für die hier untersuchten kindlichen Tumore bestätigt.3) Die in den untersuchten Tumorgruppen bestehenden signifikanten Unterschiede bei nahezu allen Vergleichen der Immunreaktion des GRAF- AK mit jeweils einem der drei FAK- AK sind am ehesten durch den insgesamt fehlenden Nachweis des GRAF- Proteins bedingt.4) An kryokonserviertem Material war GRAF vereinzelt schwach nachweisbar, so dass sich beim Vgl. der Proteinexpression von GRAF an identischen Tumorgewebeproben in den beiden unterschiedlichen Konservierungsformen rechnerisch ein eben noch signifikanter Unterschied ergab, obwohl die Immunreaktion mit dem GRAF- AK im Gesamtkollektiv nahezu fehlte. Beim Vergleich der Immunreaktion der drei verschiedenen FAK- AK in beiden Konservierungsformen ergab sich ein signifikanter Unterschied für die AK FAK C 903 und FAK A 17.5) Zusammenfassend für alle untersuchten Tumorgruppen, als auch bei verschiedenen Gewebekonservierungen, zeigte der FAK C 20- AK die homogensten Ergebnisse bzgl. der FAK- Proteinexpression. Im Einzelfall wäre für die Neuroblastome der AK FAK C 903 zu bevorzugen, während für die Rhabdomyosarkome die Anwendung von FAK C 20 oder FAK A 17 günstiger erscheint. 6) Die Wachstumsfraktion (MIB-1 Immunreaktivität) für die untersuchten Tumorgruppen lag insgesamt zwischen 0 und 38%.. Beim Vgl. der Wachstumsfraktionen zeigte sich ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen Tumorgruppen, wobei sich vor allem für die Gruppe der RMS deutlich höhere Werte ergaben.7) Im Bezug auf das Gesamtkollektiv war nur eine geringe Korrelation zwischen Wachstumsfraktion und Mitoserate nachweisbar, was sich am ehesten aus der erwartungsgemäß niedrigeren Mitoserate im Verhältnis zum umfangreicheren Detektionsrahmen des MIB-1 AK ergibt.8) Beim Vgl. der NEP- Fälle mit den Fällen ohne präoperativ durchgeführte Chemotherapie war im Hinblick auf die Wachstumsfraktion (MIB-1) kein signifikanter Unterschied nachweisbar, was wahrscheinlich in erster Linie auf die zwei relativ kleinen Teilgruppen bzw. Stichprobengrößen zurückzuführen ist.9) Beim Vgl. der Höhe der Wachstumsfraktion (MIB-1) im Hinblick auf die Stärke der Immunreaktivität von FAK war in allen vier Tumorgruppen und für alle drei FAK- AK kein statistisch signifikanter Unterschied nachweisbar. Die Wachstumsfraktion (MIB-1) muss im Fall der untersuchten soliden Tumoren des Kindesalters sehr wahrscheinlich als unabhängiger prognostischer Faktor gewertet werden., bei einer insgesamt sehr geringen Mitoserate.10) Zwischen den Tumorgruppen fand sich kein statistisch signifikanter Unterschied bzgl. dem Ereignis- freien Überleben und dem Gesamtüberleben, sowie der berechneten Ereignis- freien Überlebenswahrscheinlichkeit und der Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit.11) Es konnte für die einzelnen Tumorgruppen kein signifikanter Einfluss Zusammenhang der Wachstumsfraktion (MIB1- Reaktion) auf dasmit dem Gesamtüberleben nachgewiesen werden.Um weiteren Aufschluss über den Regulationsmechanismus von GRAF und das Zusammenspiel mit FAK und anderen an der Signaltransduktion beteiligten, regulativen Proteinen, wie bspw. der MAPK, im Hinblick auf die Tumorentstehung zu erhalten, müssen nun weitere Untersuchungen dieser Proteine an größeren Stichprobengrößen pro Tumorgruppe folgen. Weiterhin sind vergleichende Untersuchungen an entsprechendem nicht malignem Gewebe, sowohl auf Proteinebene als auch auf molekularer Ebene notwendig. Im Hinblick auf die Wachstumsfraktion (MIB-1 Immunreaktivität) könnten dann individuell ermittelte Schwellenwerte und eine Korrelation mit der Expression von GRAF und FAK, sowie klinischen Parametern (Tumorstadium und grad) genauere Aussagen im Hinblick auf Prognose, Ansprechen auf Therapie und Überlebenschancen ermöglichen. In the current study pathologic sections of formaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissues of childhood tumors were analyzed immunohistochemically. In detail 23 Nephroblastomas, 26 Neuroblastomas, 12 Ewing sarcomas and 18 Rhabdomyosarcomas and additionally five Ganglioneuromas were investigated in multi- tissue sections at the protein level. Three different antibodies against the signal transduction protein FAK and one against the human GRAF protein were used to perform immunohistochemical staining. For comparison the investigation was also done on some frozen sections. Another antibody against the Ki- 67 protein was used to analyse the proliferation index of the tumors. Additionally mitosis counts were done in the same tumor sections. The results of proliferation index were compared to mitosis counts, FAK- Expression and survival data, as well as between Nephroblastomas with and without preoperatively performed chemotherapy.The immunohistochemical analysis of the human GRAF protein is the first analysis to be done in these childhood tumors. We could not show a relevant expression of GRAF in any of the four examined tumor groups. Considering current literature, possible reasons could be regulative influences in the signaling transduction process changing the protein structure, like down regulated, incorrect or missed protein expression due to molecular changes of GRAF which was already suspected to have tumor suppressor properties. Therefore the absent expression of the human GRAF protein could possibly further the tumorigenic process. FAK expression could be detected in almost all the tumors examined, which underlines the already well-known importance of pathogenesis of many cancers and also the analysed childhood tumors of this study. Comparing the results of three different antibodies used on all sections of the four tumor groups and considering the different fixations of the tissue overall the FAK C 20 antibody is the most homogenous one to show FAK expression. FAK C 903 antibody should be preferred by immunohistochemical analysis only for Neuroblastomas, whereas for Rhabdomyosarcomas the use of other antibodies thanof FAK C 903, like FAK C 20 or FAK A 17 antibody is favourable, seems to be a better option.The proliferation index showed significant statistical differences between the tumor groups examined. Also a slight correlation between mitosis counts und proliferation index could be seen. Focusing on proliferation index there was no significant statistical difference between Nephroblastoma with and without preoperatively performed chemotherapy and no influence on survival data overall. By comparing the proliferation index with FAK- expression no significant statistical correlation could be found, suggesting that the proliferation index is an independent prognostic factor concerning the examined childhood tumors. Between the four tumor groups there was no significant statistical difference either regarding event- free and overall survival data. To more information about the regulatory pathomechanisms and the interaction of GRAF, FAK and other proteins of Integrin signaling transduction pathway, like MAPK, and their influence on tumor pathogenesis, further studies on these proteins in bigger sample sizes per group are recommended. Especially in comparison with the results of non- malignant sections and in looking at protein levels as well as at molecular changes. Furthermore with regard to the proliferation index individual cut offs could be determined and correlated with GRAF and FAK expression, as well as clinical parameter such as tumor staging and grade, and might give evidence on prognosis, response to therapy and survival odds.